喜旱蓮子草與烏蘞莓等植物提取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性研究

江 奕，陳鳳毛

(南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病(pine wilt disease)又稱松樹萎蔫病，是一種由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)寄生，宿主為松樹，天牛作為傳播媒介，伴生細(xì)菌和真菌以及人為干涉等外部環(huán)境變化引起的松樹毀滅性病害[1]。自20世紀(jì)80年代在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來，國內(nèi)研究者采取了各種措施來防治該病，但危害范圍仍不斷擴(kuò)大，現(xiàn)已擴(kuò)展到華東、東北、華南、西南等多個(gè)地區(qū)，對(duì)我國的松樹資源和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了巨大威脅[2-3]。目前主要使用藥劑進(jìn)行防治，雖然見效快、效果好，但是用量大、成本高，容易引起環(huán)境污染，嚴(yán)重危害生物多樣性和生態(tài)安全。

隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷加強(qiáng)，如何利用自然、綠色的天然產(chǎn)物對(duì)線蟲進(jìn)行有效防治備受世界各地研究人員的關(guān)注[4-5]。而我國更是早在漢代就有了利用植物進(jìn)行病蟲害防治的記載[6-7]。近年來，國內(nèi)對(duì)植物殺蟲劑方向的研究相繼開展，文艷華等[8]研究發(fā)現(xiàn)毛魚藤(Paraderriselliptica)、狼牙刺(Sophoradavidii)、粗榧(Cephalotaxussinensis)等植物提取物對(duì)松材線蟲有強(qiáng)致死性。巨云為等[9-10]研究表明用苦楝(Meliaazedarach)樹皮、果實(shí)以及萬壽菊(Tageteserecta)乙醇粗提取液浸泡線蟲可將其殺死。高雯芳等[11]報(bào)道沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)提取物不僅殺蟲效果顯著而且活性更好。焦宏偉等[12]首次發(fā)現(xiàn)采用質(zhì)量濃度為10 g/L的牡丹(Paeoniasuffruticosa)莖皮、黃連(Coptischinensis)和大黃(Ligulariaduciformis)提取液對(duì)松材線蟲成蟲和蟲卵具有強(qiáng)致死作用。

植物源化合物為植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，相比于化學(xué)藥劑對(duì)生態(tài)環(huán)境影響更小。因此，尋找并合理利用植物源化合物殺死線蟲，對(duì)線蟲病防治具有重要意義[13]。本研究采用浸漬法測(cè)定了喜旱蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)、烏蘞莓(Cayratiajaponica)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)等30 種植物乙醇提取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性，進(jìn)一步對(duì)毒殺活性強(qiáng)的喜旱蓮子草、烏蘞莓化學(xué)成分進(jìn)行分離提取，并研究這兩種植物萃取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性，為研發(fā)植物源殺線劑[14-17]提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試植物的采集

于江蘇省南京市和云南省昆明市采集供試的30種植物，具體供試部位見表1。采用實(shí)驗(yàn)室蒸餾水洗凈后，將其放置在陰涼通風(fēng)處風(fēng)干粉碎后，過孔徑為0.3 mm的篩，遮光儲(chǔ)存以備后用。

表1 供試植物名錄

1.2 供試線蟲液與卵液制備

篩選出特征明顯的松材線蟲，在25 ℃培養(yǎng)箱中用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)培養(yǎng)9～13 d。待灰葡萄孢被完全取食后，用貝爾曼漏斗法分離線蟲，再加入無菌水制成活力最佳的線蟲液(2 000 條/mL)，4 ℃密封備用。

將產(chǎn)卵雌蟲吸入含有蒸餾水的培養(yǎng)皿中產(chǎn)卵，25 min后將雌蟲從中吸出，蟲卵則留在培養(yǎng)皿上。加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過氧化氫對(duì)蟲卵處理2 min，用無菌水反復(fù)清洗線蟲卵，并配制成約為2 個(gè)/μL的卵粒懸浮液。

1.3 供試植物提取物的制備

稱取100 g樣品，并將其浸泡在500 mL無水乙醇中，室溫放置24 h后過濾，再加入等量無水乙醇浸泡濾渣，反復(fù)浸泡過濾3次。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并的濾液經(jīng)減壓濃縮至稠膏狀粗提物后停止，再將稠膏狀物25 ℃靜置30 min，獲得植物乙醇提取物備用。

分別取5 g喜旱蓮子草和烏蘞莓乙醇提取物，用少量無水乙醇溶解后，加入250 mL蒸餾水加熱溶解成懸浮液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加石油醚連續(xù)萃取3次。剩余水層依次用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮回收各有機(jī)溶劑，得到相應(yīng)萃取物。

1.4 30種植物乙醇提取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性測(cè)定

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)分別注入100 μL線蟲懸浮液，再加入100 μL 100 g/L植物乙醇提取物及800 μL蒸餾水(含體積分?jǐn)?shù)2%丙酮)混勻，殺蟲液最終質(zhì)量濃度為10 g/L。以含2%丙酮的蒸餾水作為空白對(duì)照組，重復(fù)3次。于25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)箱中，靜置24和48 h，分別測(cè)定線蟲死亡數(shù)，并計(jì)算相應(yīng)的校正死亡率。

校正死亡率=(處理組線蟲死亡率-對(duì)照組線蟲死亡率)/(1-對(duì)照組線蟲死亡率)×100%。

按照文獻(xiàn)[18]方法對(duì)殺蟲活性強(qiáng)弱進(jìn)行分級(jí)：校正死亡率≤10.0%，殺線活性極弱，用“-”表示；10.0%<校正死亡率≤30.0%，殺線活性弱，用“+”表示；30.0%<校正死亡率≤50.0%，殺線活性中，用“++”表示；50.0%<校正死亡率≤80.0%，殺線活性強(qiáng)，用“+++”表示；校正死亡率>80.0%，殺線活性極強(qiáng)，用“++++”表示。

1.5 喜旱蓮子草和烏蘞莓對(duì)松材線蟲成蟲及蟲卵的毒殺活性測(cè)定

1.5.1 兩種植物提取物及其萃取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性測(cè)定

分別稱取5 g提取物及各萃取物，用蒸餾水(含2%丙酮)溶解，并稀釋定容配制成5個(gè)濃度梯度的藥液。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)注入0.2 mL線蟲懸浮液，再加入0.2 mL的藥液，用無菌水補(bǔ)齊不足，使得各孔內(nèi)的液體總體積相等。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)測(cè)試的藥液有效濃度范圍，最終藥液的質(zhì)量濃度梯度為：10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 g/L。以含2%丙酮的蒸餾水為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)。于25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24、48和72 h后，測(cè)定線蟲死亡數(shù)，并計(jì)算相應(yīng)的校正死亡率。

1.5.2 兩種植物提取物及其萃取物對(duì)蟲卵的孵化活性測(cè)定

在培養(yǎng)板各孔中加入100 μL線蟲卵懸液，按1.4所述方法配制濃度，進(jìn)行3次重復(fù)，在25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后開始觀察，在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄松材線蟲蟲卵孵化情況，32 h后結(jié)束觀察，通過鏡檢統(tǒng)計(jì)線蟲卵數(shù)，并計(jì)算相應(yīng)的線蟲卵累計(jì)孵化率和孵化抑制率。

線蟲卵累計(jì)孵化率=孵化線蟲總數(shù)/線蟲總卵數(shù)×100%；

蟲卵孵化抑制率=(對(duì)照組蟲卵累計(jì)孵化率-處理組蟲卵累計(jì)孵化率)/對(duì)照組蟲卵累計(jì)孵化率×100%。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016結(jié)合DPS 9.01處理和分析數(shù)據(jù)，得到各處理物濃度與線蟲校正死亡率的線性關(guān)系方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 30種植物提取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性

本試驗(yàn)測(cè)定了各種供試植物提取物溶液對(duì)松材線蟲成蟲的毒殺活性,并用線蟲的校正死亡率來判斷供試植物提取物對(duì)線蟲的毒殺效果。從結(jié)果(表2)可以看出，所采集的30種植物的乙醇提取物對(duì)松材線蟲成蟲都有不同程度的毒殺作用,喜旱蓮子草和烏蘞莓提取物對(duì)松材線蟲表現(xiàn)出強(qiáng)毒殺活性，24 h后線蟲校正死亡率均達(dá)到100%。此外，澤漆(Euphorbiahelioscopia)、辣蓼(Polygonumflaccidum)、紫花地丁(Violaphilippica)和迷迭香的乙醇提取物在處理48 h后，也表現(xiàn)出較強(qiáng)活性，處理線蟲校正死亡率分別為54.56%、51.84%、63.47%和72.15%；絡(luò)石(Trachelospermumjasminoides)、大花旋復(fù)花(Inulabritanica)、冬青衛(wèi)矛(Euonymusjaponicus)等10種提取物的48 h處理線蟲校正死亡率為30%～50%；菖蒲(Acoruscalamus)、迎春(Jasminumnudiflorum)、玉簪(Hostaplantaginea)等14種提取物處理線蟲校正死亡率僅為10%～30%。

表2 植物提取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性

2.2 兩種植物乙醇提取物在不同濃度下對(duì)松材線蟲的毒殺活性

由不同濃度的植物乙醇提取物對(duì)松材線蟲的致死情況(表3)可知，處理72 h后，喜旱蓮子草和烏蘞莓的乙醇提取物對(duì)松材線蟲均有毒殺作用，其活性與濃度呈正相關(guān)。隨著藥液濃度的降低，其毒殺活性逐漸減弱，但在最低測(cè)試質(zhì)量濃度0.625 g/L時(shí)，兩種植物的乙醇提取物對(duì)線蟲作用后的校正死亡率分別為40.91%和24.62%。說明喜旱蓮子草和烏蘞莓的低濃度提取物仍具有一定的殺線活性。

表3 不同濃度的植物乙醇提取物對(duì)松材線蟲的致死率

2.3 不同極性溶劑萃取物對(duì)松材線蟲的毒殺活性

對(duì)喜旱蓮子草和烏蘞莓乙醇提取物進(jìn)一步分離，分別得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層4種萃取物，10 g/L質(zhì)量濃度對(duì)松材線蟲的致死活性見圖1。說明兩種植物萃取物的作用效果與處理時(shí)間呈正相關(guān)，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的松材線蟲死亡率均呈上升趨勢(shì)。

喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物的殺線蟲活性最強(qiáng)，其次是石油醚層，水層次之，而正丁醇層對(duì)線蟲的毒殺活性最弱；而且乙酸乙酯萃取物的作用較穩(wěn)定，24、48、72 h時(shí)校正死亡率均達(dá) 100%，其活性強(qiáng)度均保持極強(qiáng)(++++)。

烏蘞莓與喜旱蓮子草試驗(yàn)結(jié)果區(qū)別較大，水層的毒殺活性最強(qiáng)，其次是正丁醇層，乙酸乙酯層次之，石油醚層的活性最弱。且水層萃取物的作用較穩(wěn)定，但殺線有效物質(zhì)微溶于正丁醇溶劑，故水層萃取物在24、48、72 h時(shí)校正死亡率分別為86.44%、97.15%、100%，其活性強(qiáng)度均保持極強(qiáng)(++++)。

可見，具有殺線蟲活性的主要物質(zhì)分別集中在喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物和烏蘞莓水層萃取物中。且通過對(duì)比藥劑處理時(shí)長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，除喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，其余各組萃取物處理的線蟲校正死亡率隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而攀升，說明這兩種植物萃取物具有良好的持效性。

2.4 萃取物濃度對(duì)松材線蟲的毒殺活性影響

喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物和烏蘞莓水層萃取物在3個(gè)處理時(shí)間下對(duì)松材線蟲的影響結(jié)果(表4)可知，兩種植物萃取物毒殺活性與其濃度成正比，此外，其作用效果與處理時(shí)間呈正相關(guān)，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，線蟲死亡率也隨之增加。

表4 不同濃度的兩種植物萃取物對(duì)松材線蟲的毒殺作用

喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物對(duì)松材線蟲表現(xiàn)出極高的毒殺作用。以其濃度含量對(duì)數(shù)為自變量(x)，校正死亡率概率值為因變量(y)，得到72 h的毒力回歸方程y=4.211 8x+5.968 8，相關(guān)系數(shù)R=0.922 3，半致死濃度(LC50)為0.588 8 g/L，95%置信區(qū)間為0.257 2～1.348 2 g/L。

烏蘞莓水層萃取物對(duì)松材線蟲表現(xiàn)出極高的毒殺作用。以其濃度含量對(duì)數(shù)為自變量(x)，校正死亡率幾率值為因變量(y)，得到72 h的毒力回歸方程y=4.786 2x+4.512 2，相關(guān)系數(shù)R= 0.969 3，半致死濃度(LC50)為1.264 5 g/L，95%置信區(qū)間為1.781 0～0.897 8 g/L。

可見，喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物和烏蘞莓水層萃取物對(duì)于松材線蟲具有毒殺效果，并且相比其他植物喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物毒殺效果表現(xiàn)更顯著。

2.5 萃取物對(duì)松材線蟲蟲卵孵化的抑制作用

由兩種植物萃取物對(duì)松材線蟲蟲卵孵化的影響情況(表5)可知，處理32 h后喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物和烏蘞莓水層萃取物均可抑制松材線蟲卵的孵化，蟲卵孵化率增長(zhǎng)速度顯著降低，孵化抑制率均高于46%，且喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物的處理效果最佳，孵化抑制率為79.77%。結(jié)合上述兩種植物萃取物對(duì)松材線蟲成蟲的試驗(yàn)結(jié)果表明，喜旱蓮子草和烏蘞莓對(duì)松材線蟲的成蟲以及蟲卵都具有良好的抑制和毒殺作用。

表5 兩種植物萃取物對(duì)松材線蟲蟲卵孵化的影響(10 g/L)

3 討 論

20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)學(xué)者對(duì)我國具有殺蟲活性的植物進(jìn)行大范圍的篩選，李雪嬌[19]完成了203種植物的篩選工作，發(fā)現(xiàn)了有28種植物具有毒殺作用；張興等[20]初選475種植物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了128種活性較好的植物，其中包括大戟(Euphorbiapekinensis)、百花蒿(Stilpnolepiscentiflora)、紫穗槐(Amorphafruticosa)、苦豆子(Sophoraalopecuroides)等50多種植物具有較好毒殺活性。丁偉等[21]從14種中草藥植物中篩選出巴豆(Crotontiglium)、紫荊(CercisBunge)、烏頭(Aonitumcarmichaeli)、姜黃(Curcumalonga)、金錢松(Pseudolarixamabilis)具有殺蟲效果，且已有一部分被應(yīng)用到殺蟲劑開發(fā)中。國內(nèi)學(xué)者[22-23]研究的生物農(nóng)藥源植物，主要集中于楝科(Meliaceae)、菊科(Asteraceae)、豆科(Leguminosae)、唇形科(Lamiaceae)、杜鵑花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、樟科(Lauraceae)、柏科(Cupressaceae)等。全球有5%～15%的植物已被進(jìn)行了篩選，其中具有毒殺作用的植物有1 000多種。本研究即從上述文獻(xiàn)中選取了具有代表性的30種植物及其供試部位進(jìn)行殺線活性研究，尋找出更有殺線活性的植物源，為后續(xù)深入研究提供候選資源[4-14]。

本研究通過測(cè)定30種植物提取物對(duì)松材線蟲的毒殺效果，結(jié)果表明喜旱蓮子草和烏蘞莓乙醇提取物對(duì)松材線蟲有強(qiáng)烈的毒殺活性。通過對(duì)提取物進(jìn)一步萃取分離，發(fā)現(xiàn)喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物和烏蘞莓水層萃取物對(duì)松材線蟲的活性最高，且隨著質(zhì)量濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，殺線活性增強(qiáng)。這兩種植物萃取物對(duì)松材線蟲的毒殺作用強(qiáng)烈且作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，處理72 h 后松材線蟲的LC50分別為 0.588 8和0.969 3 g/L，其中喜旱蓮子草的乙酸乙酯萃取物對(duì)線蟲的孵化抑制率為79.77%。表明喜旱蓮子草乙酸乙酯萃取物和烏蘞莓水層萃取物存在能毒殺松材線蟲的有效物質(zhì)，且殺線蟲活性成分的代謝半衰期較長(zhǎng)，這為進(jìn)一步從植物中分離殺線活性物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

喜旱蓮子草作為一種全球性惡性入侵種，近年來在我國迅速蔓延，造成了航運(yùn)阻塞、傳播寄生蟲病、農(nóng)作物減產(chǎn)及養(yǎng)護(hù)草坪難等危害[24]。隨著對(duì)該植物種認(rèn)識(shí)的深入，有關(guān)于其資源化利用的研究逐漸得到科研工作者的重視，將其作為植物源農(nóng)藥就是利用途徑之一[25]。據(jù)報(bào)道，喜旱蓮子草對(duì)小菜蛾(Plutellaxylostella)的觸殺和胃毒毒力均較強(qiáng)，其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層萃取物對(duì)斜紋夜蛾(Spodopteralitura)和小菜蛾均具有忌避作用和毒殺作用，正丁醇層對(duì)小麥紋枯菌(Rhizotoniacerealis)、水稻紋枯菌(Rhizoctoniasolani)、番茄枯萎菌(Fusariumoxysporum)和玉米小斑菌(Bipolarismaydis)具有良好的抑制效果[26]。楊建明等[27]發(fā)現(xiàn)喜旱蓮子草莖和葉的水提液對(duì)釘螺(Oncomelaniahupensis)有速殺效果，且濃度越高，效果顯現(xiàn)越迅速。烏蘞莓在我國資源豐富，繁殖力很強(qiáng)，主要功效有：消腫解毒，清熱利濕[28]。其提取物對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等均有抗菌效應(yīng)[29]。已發(fā)現(xiàn)烏蘞莓地上部分精油對(duì)赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)和玉米象(Sitophiluszeamais)具有很強(qiáng)的毒殺活性，并通過氣相色譜技術(shù)和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)共鑒定出37種精油成分[30]。

目前鮮見喜旱蓮子草、烏蘞莓提取物毒殺松材線蟲的報(bào)道。從經(jīng)濟(jì)角度看，市面上喜旱蓮子草的平均價(jià)格為0.006元/g，烏蘞莓平均價(jià)格為0.024元/g，兩種植物購買成本遠(yuǎn)低于其他可以殺線的中草藥植物價(jià)格，且喜旱蓮子草和烏蘞莓繁殖快，一年四季均可采收，其他商用價(jià)值較少，用作殺線植物更加合理。若喜旱蓮子草和烏蘞莓作為殺線植物研究其活性，將大大拓展其發(fā)展空間，為天然產(chǎn)物農(nóng)藥的研究提供新材料。故采用喜旱蓮子草和烏蘞莓提取物開展防治松材線蟲病的研究，提高了兩種植物的應(yīng)用價(jià)值，也為松材線蟲病防治研究提供了新的思路。