氮沉降和接種菌根真菌對灌木鐵線蓮非結構性碳水化合物及根際土壤酶活性的影響

張曉榮，段廣德，郝龍飛*，劉婷巖，張 友，張盛晰

(1.內蒙古農業(yè)大學林學院，內蒙古 呼和浩特 010019；2.內蒙古自治區(qū)林業(yè)工作總站，內蒙古 呼和浩特 010020)

干旱半干旱區(qū)土壤自然含氮量較低，受農牧業(yè)發(fā)展的影響，大量氮素以沉降形式進入生態(tài)系統(tǒng)，一定程度緩解了該地區(qū)土壤氮素的限制，顯著影響植物生長，同時也造成生態(tài)系統(tǒng)結構和功能的改變[1]。以往研究表明，氮沉降對植物的地上形態(tài)指標、根系形態(tài)結構、生物量分配比例以及光合生理過程等具有一定的影響[2]。過量的氮會導致植物光合速率下降、植物體內營養(yǎng)失衡、植物抗逆性(耐寒、抗旱、抗病蟲害等)減弱以及森林生態(tài)系統(tǒng)多樣性降低[3-4]。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)可以與90%以上植物形成共生關系，幫助宿主植物吸收土壤中的礦質養(yǎng)分，提高植物對各種非生物脅迫的抵抗力[5]，同時植物將一部分碳水化合物作為交換供給AMF生長[6]。姜琦等[7]研究發(fā)現(xiàn)，外源氮輸入使杉木(Cunninghamialanceolata)與AMF的共生關系更加密切，可促進植物吸收養(yǎng)分，增強植物對逆境適應能力。

非結構性碳水化合物(non-structure carbohydrate，NSC)既可以反映植物體內碳收支平衡狀況，又體現(xiàn)植物對外界環(huán)境的抗逆性[8]。植物體內NSC含量的動態(tài)變化受溫度、水分、CO2濃度和氮沉降等環(huán)境因子影響[9-10]；其中氮沉降顯著影響土壤微生態(tài)環(huán)境，進而影響植物體內NSC含量[11]。土壤微生態(tài)環(huán)境變化影響植物根際理化性質、土壤微生物群落結構及養(yǎng)分轉化相關酶活性[12]。馬偉偉等[13]對高山林地土壤酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度氮抑制β-D-葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和酸性磷酸酶活性，而對過氧化物酶和多酚氧化酶無顯著影響。王凱等[14]研究發(fā)現(xiàn)，隨著氮輸入量的增加，楊樹(Populusspp.)苗木細根中可溶性糖含量增加，而淀粉含量無顯著差異。向芬等[15]研究發(fā)現(xiàn)適量的氮添加能提高植物葉片NSC含量和氮相關酶的活性。宰學明等[16]通過對菌根化濱梅(Prunusmaritima)苗木的研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根能增加根際土壤酶的活性，改善苗木的微生態(tài)環(huán)境，從而提高根際土壤肥力?？偨Y以往研究發(fā)現(xiàn)，關于根際土壤酶和NSC含量對氮沉降響應及菌根效應多為單一因素的響應研究，而二者交互作用的相關研究鮮見報道。

灌木鐵線蓮(Clematisfruticosa)是耐寒、耐旱的直立灌木，多分布于干旱的沙丘、荒漠等地區(qū)[17]，對于維護干旱沙漠地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用。本研究對比分析不同氮沉降水平下，1年生灌木鐵線蓮菌根苗與非菌根苗各器官非結構性碳水化合物分配和根際土壤酶活性的變化，旨在探討菌根化灌木鐵線蓮調控植物NSC合成及根際土壤酶活性應對氮沉降脅迫的機制，以期為全球氣候變化背景下探究植物生長策略與維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

灌木鐵線蓮種子采集于內蒙古呼和浩特市新城區(qū)水磨村(111.84°E，40.96°N)，屬于典型的溫帶大陸性氣候，年平均氣溫4.9 ℃，年平均降水量320～450 mm，土壤主要為栗褐土。

將供試種子用2%(質量分數(shù))的KMnO4溶液消毒30 min，用去離子水洗凈并播種。叢枝菌根真菌選擇試驗區(qū)優(yōu)勢菌根真菌摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和根內根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)作為菌種。兩種AMF菌劑擴繁的寄主植物為紫花苜蓿(Medicagosativa)，擴繁基質為沙土(體積比為3∶1)混合物，最終的接種菌劑為擴繁基質、侵染根段、孢子和菌絲的混合物。施用的固體菌劑中孢子密度為18 700 個/kg。

1.2 試驗方法

1.2.1 接菌處理

試驗設置4個接菌處理，分別為：單一接菌[根內根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)，編號+R；摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)，編號+F]、混合接菌(根內根孢囊霉和摩西斗管囊霉體積比1∶1的混合菌劑，編號+RF)和未接菌處理(未接菌，編號-M)。2019年10月，在育苗盆(直徑為15 cm)中放入高溫高壓滅菌基質(土與蛭石體積比為2∶1)至盆高4/5處，然后在滅菌基質上平鋪等量混勻的30.0 g固體菌劑。對照處理中施等量固體滅菌基質，消毒后的灌木鐵線蓮種子播入其中，其上再用滅菌基質覆蓋。保證苗木生長的根系與菌劑充分接觸，每盆質量控制1.0 kg；澆透水后，置于內蒙古農業(yè)大學人工氣候室(溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，最大光照度10 000 lx)培養(yǎng)，每盆保留3株苗木。

1.2.2 模擬氮沉降處理

1.3 根際土壤酶測定

模擬氮沉降處理結束15 d后，通過抖落法取下植物根際土壤。土壤酶活性的測定包括土壤碳相關酶[β-1，4葡萄糖苷酶(BG)]、土壤氮相關酶[亮氨酸氨基肽酶(LAP)和β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖苷酶(NAG)]、土壤磷相關酶[酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)]，具體測定參考Sinsabaugh等[20]的方法。BG、NAG、ACP酶的測定：稱取0.25 g新鮮根際土壤，加入相應醋酸緩沖液配制的不同反應底物溶液4 mL，培養(yǎng)4 h后，提取2.5 mL上清液于試管中，加入NaOH終止反應和顯色，使用UV-2800H紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)在410 nm處測定吸光度。LAP和ALP的測定方法稍有不同，即：稱取0.35和0.25 g新鮮土樣后，分別采用Tris-羥甲基-氨基甲烷緩沖液和碳酸鹽緩沖液配制相應底物溶液，其中LAP提取上清液后不加NaOH，測定吸光度，以對硝基苯酚的濃度表征酶活性[19]。

1.4 非結構性碳水化合物的提取及測定

土壤采樣的同時，采用全株破壞性取樣獲取植物樣品。每個處理取15株苗木，分成根、莖、葉3個部分。用去離子水清洗雜質并吸干表面水分后，編號裝入封口袋內，用冷藏箱帶回實驗室。105 ℃殺青10 min，在75 ℃的烘箱內烘干至恒量，并將烘干的樣品磨碎，過孔徑為0.149 mm的篩子，裝入黑暗密閉的容器內干燥保存，進行非結構性碳水化合物(NSC)的測定。NSC含量采用改進的苯酚-濃硫酸法測定，可溶性糖(SS)和淀粉(ST)含量的測定參照文獻[21]。SS用80%(體積分數(shù))乙醇溶液浸提，ST濃度加淀粉酶反應后過濾，分別取上清液與苯酚和濃硫酸反應，在490 nm波長處測定其吸光值。通過測定上清液葡萄糖濃度分別計算轉換得到SS和ST含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0對接菌和氮沉降處理進行單因素方差分析和雙因素交互作用分析，采用LSD多重比較法檢驗各處理苗木NSC和根際土壤酶活性的差異顯著性(顯著性水平為0.05)。采用Sigmaplot 10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 氮沉降及接菌處理對灌木鐵線蓮苗木根際土壤酶活性的影響

經測定發(fā)現(xiàn)，接種菌根真菌極顯著影響灌木鐵線蓮苗木根際土壤酶活性(P<0.01)。氮沉降及二者交互作用顯著影響亮氨酸氨基肽酶(LAP)、β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖苷酶(NAG)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)活性(P<0.05)，而對β-1，4葡萄糖苷酶(BG)活性無顯著影響(表1)。未接菌(-M)處理下，隨氮沉降量遞增，BG和LAP活性呈增加的趨勢，NAG活性呈降低的趨勢，與磷相關的根際土壤ACP和ALP活性在高氮(HN)條件下顯著增加。在單一接種根內根孢囊霉(+R)和摩西斗管囊霉(+F)處理下，BG活性隨著氮沉降量的遞增無顯著變化，LAP、NAG均在低氮(LN)條件下較大，而ALP在HN條件達到最大。與-M相比，單一接種摩西斗管囊霉(+F)和混合接種根內根孢囊霉和摩西斗管囊霉(+RF)處理下，各氮沉降處理的NAG活性顯著下降。不施氮(CK)條件下，單一接菌和混合接菌顯著增加BG、LAP和ALP活性，而NAG活性顯著降低；CK條件下，-M與+RF處理相比，根際土壤酶BG、LAP、ACP、ALP活性分別降低了80.6%(P<0.05)、98.5%(P<0.05)、44.7%(P<0.05)、32.5%(P<0.05)，而NAG顯著增加3 104.7%(P<0.05)。中氮(MN)條件下，-M處理根際土壤酶LAP活性較+R處理顯著增加155.5%(P<0.05)，-M處理根際土壤酶ACP和ALP活性較+F處理分別顯著降低61.0%(P<0.05)和38.3%(P<0.05)(表1)。

表1 氮沉降和接種菌根真菌對灌木鐵線蓮苗木根際土壤酶活性的影響

2.2 氮沉降及接菌處理對灌木鐵線蓮苗木非結構性碳水化合物含量的影響

氮沉降、接種菌根真菌及二者交互作用極顯著影響灌木鐵線蓮苗木可溶性糖(SS)、淀粉(ST)和非結構性碳水化合物(NSC)的含量，且顯著影響根、莖和葉中SS和NSC含量。氮沉降和接菌處理下，苗木體內SS、ST和NSC含量的變化趨勢均相同，且苗木體內SS含量高于ST含量(圖1)。不同氮沉降條件下，-M處理苗木各器官的SS、ST和NSC含量高低分布順序為莖<根<葉。除CK條件外，各接菌處理的苗木ST含量在葉中最高，SS和NSC含量高低分布順序為根<莖<葉。不同氮沉降條件下，所有接菌處理的苗木SS、ST和NSC含量明顯高于未接菌處理，且在+F處理下苗木SS、ST和NSC含量均達到最大。+R和-M處理下，隨著氮沉降水平的遞增，SS、ST和NSC含量均呈先降低后增加的趨勢；而+RF處理下，呈先增加后降低的趨勢。在LN、MN、HN條件下，-M處理較+F處理的SS含量分別顯著降低77.8%、81.9%和70.1%。在CK和HN條件下，-M處理相較于+F處理的ST含量分別顯著降低63.5%和65.7%。HN條件下，+F處理苗木根內ST和NSC含量達到最大值，莖和葉內SS和NSC含量均達到最大值。LN條件下，+F處理苗木根內ST含量比葉顯著降低58.7%(P<0.05)，根內NSC含量則比葉降低54.7%(P<0.05)。HN條件下，+F處理苗木根內SS含量比葉降低54.1%(P<0.05)(圖1)。

不同大寫字母表示同一接菌處理下各氮沉降水平間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一氮沉降水平下各接菌處理間差異顯著(P<0.05)。Different capital letters indicated significant differences among different nitrogen deposition treatments under the same inoculation treatment(P<0.05)，different lowercase letters indicated significant differences among different inoculation treatments under the same nitrogen deposition treatment(P<0.05).

2.3 根際土壤酶活性和非結構性碳水化合物的相關性分析

不同氮沉降條件和接菌處理下苗木的SS、ST、NSC含量與根際土壤BG活性達到顯著水平(P<0.05)，與LAP、NAG、ACP和ALP活性均達到了極顯著水平(P<0.01)。在氮沉降和接種菌根真菌交互作用的影響下，SS、ST、NSC含量與根際土壤酶NAG活性呈極顯著負相關(P<0.01)，與BG、LAP、ACP和ALP活性均呈顯著正相關(P<0.05)。與磷相關的ALP活性和SS、ST、NSC含量的相關系數(shù)最高，與碳相關的BG活性和SS、ST、NSC含量的相關系數(shù)最低(表2)。

表2 灌木鐵線蓮苗木根際土壤酶活性與非結構性碳水化合物含量相關性分析

3 討 論

3.1 接菌處理調控苗木根際土壤酶活性對氮沉降的響應

土壤微生物與植物根系通過分泌根際土壤酶影響根際微生態(tài)環(huán)境中礦質元素(碳、氮、磷)的轉化和分解[22-23]。本研究結果顯示，氮沉降、接種菌根真菌及兩者交互作用顯著影響土壤氮和磷養(yǎng)分循環(huán)相關酶，原因可能是氮沉降和接種菌根真菌增強植物礦質元素吸收和光合能力，導致根際土壤養(yǎng)分逐漸受限，進而土壤酶活性顯著增強[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在單一接菌處理下，與氮相關的兩種酶活在低氮條件下較大，而與磷相關的ALP活性則在高氮條件下達到最大。該結果與以往關于不同施氮條件下高山林地土壤酶活性的研究結果存在差異[13]，其原因可能是接菌處理增加了植物的氮素吸收，而低氮條件下，土壤中直接可吸收利用的氮素相對不足，故與氮相關的酶活性優(yōu)先增強；隨著氮沉降量的遞增，其酶活性逐漸下降；在高氮條件下，由于土壤有效氮含量的增加引起了磷供應相對不足，激發(fā)了磷酸酶的分泌，導致其活性增強[25]。隨氮沉降量的遞增，非菌根苗養(yǎng)分吸收低于菌根苗，低氮輸入已基本滿足苗木氮需求，土壤微生物減少氮獲取酶的產生，故與氮相關的NAG活性降低，隨著植物生長發(fā)育對營養(yǎng)元素的消耗，土壤對碳需求逐漸受限，進而導致土壤微生物產生碳相關的BG活性增加[19]。以上結果與以往關于資源配置理論解釋土壤微生物及土壤酶活性對氮添加響應研究一致[26-27]。無外源氮輸入條件下，除NAG酶外，菌根苗根際土壤酶活性高于非菌根苗，原因可能為菌根的形成改善了微生態(tài)環(huán)境，促進了植物對養(yǎng)分的吸收和利用，導致土壤微生物(細菌、真菌、放線菌)養(yǎng)分限制增強，進而促進了微生物酶的釋放[28]。

3.2 接菌處理調控苗木非結構性碳水化合物對氮沉降的響應

非結構性碳水化合物(NSC)的含量大小反映植物對環(huán)境的適應策略[29]。接種菌根真菌提高了植物SS、ST和NSC積累量，這與以往研究結果一致[6]。原因為接菌處理增強了植物光合能力，一定范圍的氮添加緩解了氮限制，進一步促進NSC的合成[30]。研究也發(fā)現(xiàn)，單一接種摩西斗管囊霉對植物NSC含量的影響最明顯，說明摩西斗管囊霉較根內根孢囊酶耐氮性更強，在調控植物生長對氮沉降的響應中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，最終導致了混合接菌中植物NSC含量居于兩種單一接菌處理之間。不同氮沉降條件下，非菌根苗各器官SS、ST和NSC含量順序為莖<根<葉，原因可能是葉作為光合作用主要器官，其NSC含量最高；其次植物將合成的NSC通過莖優(yōu)先輸送給根獲取養(yǎng)分，剩余部分貯存在莖中促進其生長[31]。以上各器官NSC分配符合植物生長策略，也與張婉婷等[32]對氮添加處理后紅砂(Reaumuriasoongarica)苗木NSC含量的研究結果相似。除無氮添加條件外，菌根苗各器官SS和NSC含量順序為根<莖<葉，原因可能是菌根共生關系有效促進了植物養(yǎng)分吸收，苗木可溶性糖向根系運輸相對減少，從而降低了根內可溶性糖含量。另外一個原因可能為接菌處理有效提高植物生長，最大限度地促進了植物地上生物量的積累，進而導致根系中的NSC相對下降。相關性分析發(fā)現(xiàn)，氮沉降和接菌處理下苗木NSC含量與根際土壤NAG活性呈顯著負相關，與其余4種酶活性均呈顯著正相關。原因可能是菌根共生關系與人工施入氮素增加了植物氮、磷吸收，促進了NSC合成，根際土壤養(yǎng)分減少導致相應土壤酶活性增強。而氮沉降處理向土壤中添加大量的氮元素，導致與氮相關的NAG活性下降[13]。研究發(fā)現(xiàn)，苗木NSC含量與磷相關的ALP活性的相關性最高，說明隨氮沉降量遞增，土壤磷逐漸成為限制植物生長的主要元素。苗木NSC含量與ACP活性的相關系數(shù)小于與ALP活性的相關性系數(shù)，原因可能是幼苗生長環(huán)境的pH偏堿性，故堿性磷酸酶活性在根際微生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用。