酒精性肝病患者腸道微生態(tài)變化研究進(jìn)展*

張改霞，陳海震 綜述， 黃 晶 審校

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是全球范圍的慢性肝病類(lèi)型，可從單純性脂肪肝發(fā)展為酒精性脂肪性肝炎(alcohol steatohepatitis，ASH)。慢性ASH會(huì)導(dǎo)致肝臟發(fā)生纖維化并進(jìn)展為肝硬化，甚至導(dǎo)致肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。其中嚴(yán)重的ASH(伴或不伴肝硬化)可導(dǎo)致酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)，這是ALD的急性臨床表現(xiàn)，與肝衰竭和高死亡率相關(guān)[1]。ALD的不同臨床轉(zhuǎn)歸可能與遺傳、免疫、飲食和腸道微生物等多種因素相關(guān)，其中腸道微生態(tài)的改變?cè)贏LD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2]。正常成人腸道中攜帶有至少1個(gè)門(mén)的細(xì)菌(約500～1000種細(xì)菌)，數(shù)量級(jí)與人體細(xì)胞數(shù)量接近，其中約99%為厭氧菌，包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、類(lèi)桿菌、真桿菌、梭菌等；其次為需氧菌及真菌，此外還有正常的病毒群、螺旋體等[3]。長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群發(fā)生數(shù)量和質(zhì)量的改變,增加腸道炎癥和通透性，導(dǎo)致全身炎癥和組織損傷/器官病變(包括肝臟)。本文將對(duì)飲酒導(dǎo)致的腸道微生態(tài)的改變，及其對(duì)ALD的促進(jìn)作用和相關(guān)生物標(biāo)志物的最新研究進(jìn)展作以綜述。

1 ALD患者腸道微生態(tài)特點(diǎn)

1.1細(xì)菌數(shù)量與構(gòu)成的改變 長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)引起腸道穩(wěn)態(tài)的一系列改變，包括腸道pH、腸道動(dòng)力、膽鹽、免疫防御因子、細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、以及細(xì)菌對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致腸道細(xì)菌菌群和腸道屏障的改變。用聚合酶鏈法或常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腸道中細(xì)菌總數(shù)大量增加，但腸道細(xì)菌的多樣性降低。對(duì)ALD患者結(jié)腸粘膜研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌菌群的改變表現(xiàn)為變形桿菌增加，擬桿菌減少[4]。長(zhǎng)期喂食酒精的小鼠糞便中乳酸桿菌降低，類(lèi)桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)減少，革蘭陰性變形桿菌門(mén)和革蘭陽(yáng)性放線菌門(mén)的比例增加，其中革蘭陰性產(chǎn)堿桿菌和革蘭陽(yáng)性棒狀桿菌顯著增加。這種生物失調(diào)可能與乳桿菌、桿菌科、小球菌屬、明串珠菌和乳球菌的顯著減少有關(guān)[5,6]。長(zhǎng)期攝入酒精也會(huì)改變回腸和肝臟的細(xì)菌多樣性，其中普雷沃氏菌不僅在回腸的粘液層中增加，也在肝臟中增加[7]，證明菌群可能從腸道向肝臟發(fā)生了轉(zhuǎn)移。另外，在酒精誘導(dǎo)的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，阿克曼氏菌的水平顯著降低，且該菌的喪失驅(qū)動(dòng)了放線菌的增加和疣微菌的減少，是腸道生態(tài)失調(diào)的早期標(biāo)志[8]。通過(guò)對(duì)雙胞胎進(jìn)行酒精使用障礙量表調(diào)查(alcohol use disorders identification test，AUDIT)，發(fā)現(xiàn)AUDIT評(píng)分高的受試者的腸道中羅斯伯里氏菌數(shù)量降低，影響腸道屏障功能，造成肝臟損傷[9]。嚴(yán)重的AH患者腸道以雙歧桿菌和鏈球菌數(shù)量較多和奇異菌較少為特征[10]，而酒精性肝硬化患者腸道普雷沃氏菌、腸桿菌、韋氏菌和鏈球菌等潛在危險(xiǎn)細(xì)菌也顯著增加[11-13]。

1.2 細(xì)菌及其產(chǎn)物的移位 在腸道內(nèi)，微生物及其代謝產(chǎn)物通過(guò)門(mén)靜脈轉(zhuǎn)移到肝臟。肝臟通過(guò)向膽道和體循環(huán)釋放膽汁酸和生物活性介質(zhì)與腸道溝通。對(duì)小鼠酒精飲食喂養(yǎng)的不同階段研究發(fā)現(xiàn)，飲酒早期就出現(xiàn)了腸道通透性增加以及細(xì)菌及其產(chǎn)物移位；通過(guò)細(xì)菌在腸系膜淋巴結(jié)中定量培養(yǎng)證明， 繼續(xù)飲酒會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)[5]。經(jīng)腸道屏障和門(mén)靜脈移位的細(xì)菌或內(nèi)毒素激活肝臟巨噬細(xì)胞，誘發(fā)先天性和獲得性免疫反應(yīng)導(dǎo)致肝臟損傷，與酒精對(duì)肝臟的直接作用共同促進(jìn)ALD的發(fā)展[14]。因此，來(lái)源于腸道菌群的內(nèi)毒素可以作為細(xì)菌移位的標(biāo)志物之一。腸道菌群紊亂會(huì)誘導(dǎo)對(duì)腸道屏障功能具有重要保護(hù)作用的短鏈脂肪酸和飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸的產(chǎn)生減少，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌和微生物毒素發(fā)生移位。研究證明可通過(guò)補(bǔ)充短鏈脂肪酸和飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸減輕肝臟炎癥反應(yīng)[15,16]。另外，ALD中腸-肝軸循環(huán)的膽汁酸譜也發(fā)生改變，其中結(jié)合膽汁酸和總膽汁酸濃度升高，在腸道菌群紊亂和屏障損傷中發(fā)揮重要的作用[17]。

1.3 腸道真菌的變化 健康人體腸道真菌菌落主要由酵母菌、馬拉色菌和念珠菌組成。對(duì)ALD患者的腸道真菌菌群研究顯示，真菌多樣性和豐富度降低，其中，腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、曲霉屬相對(duì)增加，而念珠菌屬相對(duì)降低，主要表現(xiàn)為近平滑念珠菌降低，而白色念珠菌增加[18,19]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲酒會(huì)導(dǎo)致腸道真菌菌群及β-葡聚糖向全身循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)，在骨髓嵌合體小鼠模型中發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖可通過(guò)C型凝集素樣受體CLEC7A誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞和其他可能來(lái)自骨髓的細(xì)胞發(fā)生炎癥，引起IL-1β表達(dá)分泌增加導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，進(jìn)一步促進(jìn)酒精誘導(dǎo)的肝病的發(fā)展[19]。另一方面，增加的白色念珠菌可以分泌一種細(xì)胞溶解肽外毒素-念珠菌溶素，可以直接損傷上皮細(xì)胞和粘膜，也可以通過(guò)c-Fos和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在乙醇喂養(yǎng)的小鼠中證明念珠菌溶素不引起明顯的腸道破壞，主要是通過(guò)腸上皮細(xì)胞間隙進(jìn)入肝臟，以計(jì)量依賴方式損傷肝細(xì)胞[18]。

1.4 腸道病毒的改變 人類(lèi)腸道病毒是每個(gè)人特有的，主要包含噬菌體。研究發(fā)現(xiàn)在ALD患者中腸道病毒多樣性增加，與細(xì)菌多樣性呈負(fù)相關(guān)，但許多噬菌體與其宿主細(xì)菌總量呈正相關(guān)[20]，與其他疾病中的變化一致[21]。AH患者的病毒變化最為顯著，其中，乳球菌噬菌體和類(lèi)桿菌噬菌體的數(shù)量降低，而乳桿菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體、腸桿菌噬菌體和腸球菌噬菌體以及細(xì)小病毒科和皰疹病毒科的數(shù)量增加。并且特定的病毒分類(lèi)，如：葡萄球菌噬菌體和皰疹科病毒，與疾病嚴(yán)重程度及90天死亡率相關(guān)[20]。腸道病毒可以通過(guò)引起宿主免疫反應(yīng)直接影響宿主，也可以作為哺乳動(dòng)物病毒的來(lái)源，改變細(xì)菌微生物組成從而影響疾病。

2 腸道微生態(tài)改變?cè)贏LD發(fā)病機(jī)制中的作用

2.1 腸道屏障破壞和腸道通透性增加 完整的腸道屏障是腸肝軸相互作用的重要組成部分，由幾個(gè)物理和免疫層組成[22]。上層是粘液層，由腸杯狀細(xì)胞合成和分泌的粘蛋白組成，主要為粘蛋白2(mucoprotein 2，Muc2)，具有預(yù)防機(jī)械、化學(xué)和生物攻擊的作用，有助于維持腸道平衡[23]。長(zhǎng)期飲酒會(huì)導(dǎo)致粘液層增厚，同時(shí)會(huì)抑制抗菌凝集素再生胰島衍生3β(regenerating islet‐derived 3 beta，Reg3b)和再生胰島衍生3γ(regenerating islet‐derived 3 gamma，Reg3g) 的表達(dá)，導(dǎo)致腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)、腸道微生物組成改變，促進(jìn)ASH發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證明Muc2缺陷型小鼠可以促進(jìn)Reg3b和Reg3g的產(chǎn)生，可以降低ASH的發(fā)生[24]。中層為上皮細(xì)胞層，相鄰細(xì)胞之間通過(guò)頂端連接蛋白(包括claudins、occludins、JAMs和E-cadherins)緊密結(jié)合。酒精及其代謝物可以通過(guò)作用于緊密連接的復(fù)合物，引起通透性增加。例如：代謝產(chǎn)物乙醛誘導(dǎo)Caco-2單層細(xì)胞旁通透性增加[25]，乙醇誘導(dǎo)的CYP2E1通過(guò)硝基氧化應(yīng)激的方式增加腸道Caco-2細(xì)胞和大腸的通透性，在腸道滲漏和內(nèi)毒素血癥中起著核心作用[26]。下層為固有層，其常駐細(xì)胞群體為天然免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞。慢性ALD動(dòng)物模型證明長(zhǎng)期飲酒會(huì)誘導(dǎo)固有層炎癥細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α，與腸上皮細(xì)胞上的TNF受體I通過(guò)激活肌球蛋白輕鏈激酶而部分介導(dǎo)緊密連接破壞[27]。

2.2 腸道菌群移位加速ALD的進(jìn)展 在腸道中，酒精誘導(dǎo)的生物失調(diào)和細(xì)菌移位導(dǎo)致病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的積累[28]。PAMPs通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟，激活先天性和獲得性免疫反應(yīng)。PAMPs，如脂多糖、肽聚糖和病毒RNA等可以與Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞上的模式識(shí)別受體結(jié)合誘導(dǎo)局部炎癥。主要通過(guò)肝臟免疫細(xì)胞Toll樣受體-4(Toll-like receptor4，TLR4)和TLR2識(shí)別PAMPs，TLR信號(hào)進(jìn)一步激活下游促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致MyD88介導(dǎo)的NF-κB激活，促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)。另外，飲酒導(dǎo)致的微生物及其產(chǎn)物發(fā)生移位進(jìn)入肝臟并與Kupffer細(xì)胞上的TLR4結(jié)合，促進(jìn)miR-155的表達(dá)，增加炎癥反應(yīng)并加速纖維化進(jìn)展。在miR-155基因敲除小鼠模型中，缺乏miR-155可以減緩慢性酒精誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化[29]。同時(shí)，TLR4信號(hào)還通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的受體激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化。這些損傷過(guò)程都會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)一步增加肝損傷。此外，PAMPs除了通過(guò)門(mén)靜脈入肝引起肝臟炎癥，也可以通過(guò)體循環(huán)引起全身性炎癥反應(yīng)，增加患者不良預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)。

3 ALD誘導(dǎo)腸道微生態(tài)改變的相關(guān)生物標(biāo)志物

目前，激素仍然是ALD的主要治療方案，但療效非常有限，且易發(fā)生機(jī)會(huì)性感染。對(duì)于終末期ALD患者，肝臟移植的機(jī)會(huì)非常渺茫，短期死亡率非常高。因此，通過(guò)對(duì)ALD與腸道微生態(tài)之間的相互作用機(jī)制的不斷研究，發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)相關(guān)的ALD生物標(biāo)志物，有助于早期對(duì)ALD進(jìn)行評(píng)估，早期進(jìn)行治療。

3.1 缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF) HIF在缺氧、脂多糖存在等環(huán)境中參與抗炎或組織保護(hù)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究顯示，腸道HIF-1α對(duì)于酒精引起的腸道菌群變化、腸屏障功能損傷、內(nèi)毒素血癥和肝脂肪變性至關(guān)重要[30]。腸上皮特異性HIF-1α敲除(IEhif-1α-/-)小鼠表現(xiàn)出厚壁菌/類(lèi)桿菌比率顯著降低，阿克曼氏菌豐度增加和乳桿菌水平顯著的降低。許多屏障保護(hù)基因受HIF-1α的缺失而影響表達(dá)，導(dǎo)致腸上皮通透性增加。研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌有益于預(yù)防、治療小鼠ALD，但當(dāng)腸道中缺失HIF-1α?xí)r，其作用就會(huì)減弱[31]。HIF-1α在線粒體中也發(fā)揮重要作用，以應(yīng)對(duì)各種因素引起的氧化應(yīng)激，可能對(duì)酒精引起的肝臟氧化應(yīng)激起保護(hù)作用[32]。因此，HIF-1α可以通過(guò)多種途徑保護(hù)腸道和肝臟，并作為ALD的治療靶點(diǎn)。

3.2 溶細(xì)胞素 溶細(xì)胞素是由糞腸球菌產(chǎn)生的一種細(xì)菌外毒素。實(shí)驗(yàn)證明在AH患者糞便中，糞腸球菌的數(shù)量增加，溶細(xì)胞素陽(yáng)性的糞腸球菌的存在與AH的嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)[33]。酗酒會(huì)降低巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2(fucosyltransferase 2 ，F(xiàn)ut2)介導(dǎo)的腸道α-1-2-巖藻糖基化，而腸內(nèi)α-1-2-巖藻糖基化的缺失會(huì)促進(jìn)溶細(xì)胞素陽(yáng)性糞腸球菌在腸道生長(zhǎng)繁殖[34]。溶細(xì)胞素的作用不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有裂解活性，而且可能通過(guò)形成孔隙對(duì)真核細(xì)胞也有裂解活性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在溶細(xì)胞素陽(yáng)性的AH患者中，89%的患者在入院后180天內(nèi)發(fā)生死亡，而溶細(xì)胞素陰性的患者只有3.8%死亡，表明溶細(xì)胞素是AH患者死亡的預(yù)測(cè)因子[35]。另外，研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌噬菌體可顯著降低肝臟中的溶細(xì)胞素水平以及糞便中糞腸球菌的數(shù)量[33]。因此，F(xiàn)ut2及糞腸球菌噬菌體將是治療ALD 的重要靶點(diǎn)。

3.3 其他標(biāo)志物 腸道上皮細(xì)胞層中的兩種抗微生物劑，Reg3b和Reg3g可以修復(fù)腸道屏障的損傷，減少細(xì)菌移位和肝臟的損傷[35]。Reg3b和Reg3g的產(chǎn)生受白細(xì)胞介素22(interleukin 22，IL-22)的調(diào)節(jié)。而在ALD中，IL-22產(chǎn)生減少是由于酒精誘導(dǎo)和腸道中吲哚-3-乙酸( indole-3-acetic acid，IAA)水平降低的結(jié)果。IAA是由具有色氨酸酶活性的腸道細(xì)菌代謝色氨酸產(chǎn)生的產(chǎn)物，為微生物群衍生的芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor ，AHR)配體，該配體通路調(diào)節(jié)IL-22的表達(dá)。然而，直接補(bǔ)充IL-22可能誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)工程改造產(chǎn)生IL-22的羅伊氏乳桿菌可減少脂肪性肝炎和細(xì)菌向肝臟的移位[36]。另外，還可以補(bǔ)充IAA，或以腸道微生物作為靶點(diǎn)改善AHR通路，如補(bǔ)充益生菌、AHR配體產(chǎn)生菌或藥理性AHR配體，為ALD的治療帶來(lái)新的希望[37]。

血清中抗釀酒酵母IgG抗體(anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies, ASCA)可以作為機(jī)體對(duì)真菌或其產(chǎn)物的免疫反應(yīng)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，AH患者血清ASCA水平明顯高于對(duì)照組，證明真菌及其產(chǎn)物通過(guò)腸道屏障發(fā)生移位，并且機(jī)體對(duì)真菌的免疫反應(yīng)增強(qiáng)。單變量分析發(fā)現(xiàn)，ASCA水平與肝纖維化分期成正相關(guān)。此外，血清ASCA的升高與AH患者的死亡率也相關(guān)[38]。因此，腸道真菌可作為ALD的治療靶點(diǎn)，ASCA可用于預(yù)測(cè)AH患者的預(yù)后。

4 結(jié)論與展望

近年來(lái)，腸道微生態(tài)相關(guān)研究已經(jīng)成為許多慢性疾病的研究熱點(diǎn)。通過(guò)微生物制劑對(duì)腸道微生態(tài)環(huán)境進(jìn)行修復(fù)與改善，保護(hù)并增強(qiáng)腸道屏障，進(jìn)而減少器官損傷和炎癥反應(yīng)。因此，腸道微生態(tài)成為治療慢性肝臟疾病的最新靶點(diǎn)，如酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝炎等。但是，由于對(duì)腸道菌群的認(rèn)識(shí)和檢測(cè)方法的限制，目前對(duì)腸道菌群的改變以及機(jī)制的研究尚未明確。并且由于研究對(duì)象、檢測(cè)區(qū)域、檢測(cè)標(biāo)本的不同，結(jié)果可能具有差異性。因此，未來(lái)需要繼續(xù)深入研究腸道微生物在ALD中的改變，探索與ALD進(jìn)展相關(guān)的特異性微生物，同時(shí)尋求ALD特異的腸道微生態(tài)相關(guān)標(biāo)志物并通過(guò)腸-肝軸治療ALD。