高原鼠兔尿液的揮發(fā)性成分分析及引誘活性成分的篩選

喬衛(wèi)杰，萬俊，顧貴蓉，江濤，尕措，金洪，侯太平*

（1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2. 四川省色達縣草原工作站，四川色達626600）

化學(xué)通訊指動物產(chǎn)生的某些化學(xué)物質(zhì)，在環(huán)境中傳播，被其他個體接受，從而產(chǎn)生一系列的生理、行為活動的過程，對維持社會等級、個體與親緣識別、繁殖育幼、領(lǐng)域維護與警惕天敵起著非常關(guān)鍵的作用（劉定震，田紅，2010；Inagakiet al.，2014）。這些化學(xué)物質(zhì)被稱為信息素，尿液是信息素的重要來源（Zhanget al.，2019）。

哺乳動物尿液的化學(xué)成分復(fù)雜，可以編碼多種信息，是化學(xué)通訊的重要載體。研究動物尿液不僅能解讀動物間化學(xué)通訊密碼——信息素，還能發(fā)現(xiàn)信息素對動物行為的影響。Takacs 等（2016）通過分析褐家鼠Rattus norvegicus的尿液、糞便等排泄物化學(xué)成分，鑒定獲得39種化學(xué)成分，其中9種化學(xué)成分大量存在于雄性排泄物中；以其中6種化學(xué)成分（2-庚酮、4-庚酮、3-乙基-2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮、4-壬酮）作為引誘劑進行野外誘捕試驗，捕獲的雌性褐家鼠數(shù)量是對照組的10 倍。Silambarasan等（2019）測試了母豬的尿液、糞便、唾液和陰道分泌物，發(fā)現(xiàn)公豬面對發(fā)情母豬的尿液時，其嗅探尿液的時間更長，且分泌大量唾液，表明發(fā)情母豬的尿液中含有信息素。Rajanarayanan和Archunan（2011）在研究水牛Bubalus bubalis的4個不同發(fā)情階段的尿液時，鑒定獲得14種化學(xué)成分，并發(fā)現(xiàn)9-十八碳烯酸和4-甲基苯酚能夠誘發(fā)雄性水牛的陰莖勃起等生殖行為。對圓虎魚Neogobius melanostomus（Tierneyet al.，2013）、羅非魚Oreochromis mossambicus（Keller-Costaet al.，2016）、獅子Panthera leo（Soso & Koziel，2017）、山羊Capra hircus（Sankarganeshet al.，2018）、家犬Ca?nis familiaris（Dzi?cio?et al.，2018）的研究發(fā)現(xiàn)，動物尿液中含有攜帶信息的特異性成分，能夠?qū)⑿畔鬟f給同類，可以看出動物尿液中普遍含有信息素，能夠影響動物行為和生理狀態(tài)。

高原鼠兔Ochotona curzoniae隸屬于兔形目Lagomorpha 鼠 兔 科 Ochotonidae 鼠兔屬Ochotona，廣泛分布于青藏高原及相鄰地區(qū)（潘璇，米瑪旺堆，2016；Zhanget al.，2020），是青藏高原的關(guān)鍵物種（Smith，2010；Wilson & Smith，2015）。高原鼠兔直接刈割取食植物，破壞土壤結(jié)構(gòu)，加速草地退化，阻礙草地恢復(fù)（Weiet al.，2007；Chenet al.，2017）。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，適量的高原鼠兔密度有助于碳、氮、磷等土壤養(yǎng)分的積累，提高植物的生物量（Pang & Guo，2017；Yuet al.，2017）。高原鼠兔的主要天敵有赤狐Vulpes vulpes、香鼬Mustela altaica、獵隼Falco cherrug等，研究表明環(huán)境中增加赤狐的尿液后，高原鼠兔的行為會受到影響，包括減少移動或短距離移動、降低取食活動（魏萬紅等，2004）。而多種天敵動物如香鼬、藏犬的糞便還會抑制高原鼠兔的取食、活動等，增加隱藏時間、探頭頻次，表明高原鼠兔能夠通過化學(xué)通訊探測捕食風(fēng)險（楊國榮，2015）。

劉定震和田紅（2010）報道了許多嚙齒目Rodentia 物種的尿液研究結(jié)果，但還沒有高原鼠兔尿液的相關(guān)研究。本試驗以高原鼠兔為研究對象，采用固相微萃取-氣質(zhì)色譜聯(lián)用技術(shù)鑒定其尿液中揮發(fā)性化學(xué)成分，對比雌、雄性尿液中揮發(fā)性成分組成、含量的差異，分析篩選出高原鼠兔的潛在信息素。進一步通過曠場試驗評價潛在信息素對高原鼠兔的行為影響，篩選出高引誘活性的成分，為進一步研究高原鼠兔信息素的通訊功能提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 高原鼠兔尿液揮發(fā)性成分鑒定

1.1.1 試驗動物2019 年7 月，在四川省色達縣天然草地使用捕鼠籠捕捉處于繁殖末期的高原鼠兔，然后篩選出成年健康個體12 只，雌雄各6 只。隨后飼養(yǎng)在40 cm×40 cm×30 cm 的鋼絲籠中，喂食垂穗披堿草Elymus nutans，早晚各喂100 g，同時適量喂水。試驗流程按四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會相關(guān)要求進行。

1.1.2 尿樣采集室內(nèi)飼養(yǎng)，適應(yīng)48 h 后，開始收集尿液。當高原鼠兔產(chǎn)生新鮮尿液后，用一次性吸管吸取尿液到凍存管中，低溫保存。持續(xù)收集24 h，避免晝夜間尿液成分波動，?20 ℃保存。

1.1.3 樣品前處理檢測前2 ℃自然解凍。在15 mL 頂空瓶中加入 1.5 g NaCl 和 5 mL 尿液，置于45 ℃水浴鍋中溶解混勻，平衡5 min 備用。將100 μm PDMS 萃取纖維頭（SUPELCO，美國）在氣相色譜進樣口（250 ℃）老化30 min，插入頂空瓶，推出萃取頭水浴吸附20 min，收回。

1.1.4 固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將萃取頭插入氣相色譜進樣口（GCMS-QP2010 Plus，SHIMADZU，日本），250 ℃不分流解析3 min。進樣口溫度 250 ℃，起始溫度 45 ℃，保持 5 min；以5 ℃·min?1升溫至150 ℃，保持2 min；以10 ℃·min?1升溫至280 ℃，保持3 min。載體為氦氣，流速1.00 mL·min?1，不分流進樣。質(zhì)譜儀采用 EI 源，能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，掃描范圍30~500 m/z。

1.1.5 成分鑒定檢測結(jié)果與NIST08 質(zhì)譜庫進行類似物比對檢索，確定樣品中的揮發(fā)性成分，并用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量，采用卡方檢驗檢驗?zāi)蛞褐谐煞质欠窬哂行詣e差異。

1.2 曠場試驗篩選引誘成分

1.2.1 試驗地點與時間2020年7—9月，在四川省色達縣牧場儲藏室開展試驗。

1.2.2 試驗裝置篩選引誘成分參考Takacs 等（2016）的方法設(shè)置圓形曠場（直徑2 m，高度0.6 m，不銹鋼材質(zhì)），將圓形曠場均勻劃分成4個扇形，布置監(jiān)控攝像頭、10 w日光燈、支架和遮光圍布（圖1）。

圖1 圓形曠場試驗Fig. 1 Circular open field

1.2.3 試驗藥品10 個潛在信息素藥品包括2-甲基丁醛（98%）、2，5-二甲基吡嗪（98%）、2-庚酮（98%）、正己醇（99.5%）、喹啉（98%）、4-庚酮（98%）、壬醛（96%）、對甲酚（99.7%）、2-壬酮（99%）、苯乙醛（95%），溶劑為液體石蠟（99%），均統(tǒng)一購于上海麥克林生化科技有限公司。藥品用液體石蠟配制為濃度500 mg·L?1、體積5 mL的試驗溶液，備用。

1.2.4 試驗方法將2 mL 試驗溶液加入1 只5 mL 離心管中，用潔凈棉花塞住管口后倒置。另一只離心管中加入2 mL 液體石蠟作為空白對照組。將上述2 只離心管分別放入2 個50 mL 燒杯中，然后分別放入2 個隔離罩內(nèi)，并置于扇形區(qū)域中央，避免高原鼠兔直接接觸離心管。將放入高原鼠兔的捕鼠籠置于曠場中5 min 后，讓其自由活動10 min 后，取出高原鼠兔放回飼養(yǎng)籠。每次試驗后，將藥品區(qū)與對照區(qū)的試驗溶液進行交換，并用酒精和清水擦拭曠場裝置，掀開圍布通風(fēng)換氣。每個藥品分別用6 只雌性（編號：1~6）與6 只雄性（編號：11~16）重復(fù)試驗，每只試驗間隔24 h。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理視頻錄像記錄高原鼠兔在藥品區(qū)與對照區(qū)的活動時間，采用獨立樣本t檢驗驗證高原鼠兔對藥品的偏好性差異，使用Excel 和SPSS 25 進行數(shù)據(jù)收集與處理，使用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果

2.1 揮發(fā)性成分分析

雌雄性高原鼠兔的典型色譜圖（圖2）顯示，尿液的成分主要是烷烴類、醇類、烯烴類、酮類、醛類和吡嗪類等，共38 種（附表1），其中34 種在兩性中都有檢出。而壬醛、對甲酚僅在雌性中檢出，2-壬酮、苯乙醛僅在雄性中檢出。雄性尿液中共鑒定出36 種物質(zhì)，個體間成分差異較大，僅有3 種在6 個尿樣中同時檢測到；雌性尿液中共鑒定出36 種，其中5 種在6 個尿樣中同時檢測到。

圖2 雌性（A）和雄性（B）高原鼠兔尿液成分氣相色譜圖Fig. 2 Chromatogram of urine composition in female（A）and male（B）Ochotona curzoniae

2.2 揮發(fā)性成分相對豐度分析

雌性尿液中相對豐度最高的是2-甲基丁醛（22.46%±2.55%），與雄性的（6.64%±2.31%）差異極顯著（P=0.030），同時正己醇、4-庚酮和喹啉的相對豐度也表現(xiàn)為雌性顯著高于雄性。雄性尿液中相對豐度最高的是2，5-二甲基吡嗪（34.56%±2.63%），與雌性的（11.20%±5.45%）差異極顯著（P=0.003），且2-庚酮的相對豐度表現(xiàn)為雄性顯著高于雌性（表1）。其他26 種成分的相對豐度未見顯著差異。因此，選擇2-甲基丁醛、2，5-二甲基吡嗪、2-庚酮、正己醇、喹啉、4-庚酮、壬醛、對甲酚、2-壬酮、苯乙醛等10 個成分作為高原鼠兔的潛在信息素進行下一步試驗。

表1 雌雄高原鼠兔尿液中差異成分的平均相對豐度比較Table 1 Comparison of average relative abundance of different components in the urines between male and female Ochotona curzoniae

2.3 潛在信息素的引誘活性

曠場試驗結(jié)果表明，雌性在2，5-二甲基吡嗪藥品區(qū)的活動時間為180 s±22.43 s，極顯著高于其在對照區(qū)的活動時間（117 s±9.46 s，P=0.005）（圖3：A）；雄性未表現(xiàn)出對10 種成分的偏好（圖3：B）。

圖3 10種潛在信息素對雌性（A）和雄性（B）高原鼠兔行為的影響Fig. 3 Effects of 10 potential pheromones on the behavior of female（A）and male（B）Ochotona curzoniae

3 討論

固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一項成熟技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、醫(yī)學(xué)等，能夠有效鑒定唾液、血液、尿液等生物體液中揮發(fā)性成分（Curranet al.，2005）。目前已通過固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對家貓Felis silvestris catus（Suzukiet al.，2019）、山羊（Sankarganeshet al.，2018）、獅子（Soso & Koziel，2017）等的尿液進行了鑒定分析。尿液是動物的代謝產(chǎn)物，受動物食性、年齡、性別、環(huán)境、代謝狀態(tài)等多方面影響（劉定震等，2003），金錢豹Pan?thera pardus、獅子等肉食動物尿液中含有較多的含硫化合物（劉海彬等，2015；Soso & Koziel，2017）。本研究在高原鼠兔尿液中發(fā)現(xiàn)了烷烴類、醇類、烯烴類、酮類、醛類和吡嗪類等成分，且這些成分在不同性別、個體之間都存在種類、含量的差異。葉芳艷等（2018）提出，氣味分子編碼信息的方式有2 種：不同個體的差異成分和同種成分的不同含量。本研究認為，高原鼠兔尿液揮發(fā)性成分的種類、含量差異可能編碼了個體的信息，有待進一步采集更多樣本驗證。

2-甲基丁醛、正己醇、4-庚酮、喹啉、2，5-二甲基吡嗪、2-庚酮、2-壬酮、苯乙醛、壬醛、對甲酚等10 種成分在雌雄高原鼠兔的尿液中存在顯著差異，這10種成分在其他動物尿液也被廣泛鑒定到，甚至被確定為信息素。摘除腎上腺會降低雌性小鼠Mus musculus尿液中 2-庚酮、2，5-二甲基吡嗪等6種成分的含量，同時受這6種成分的刺激，雌性小鼠會提前進入青春期（Novotnyet al.，1986）；加州鹿鼠Peromyscus californicus的尿液中含有2-庚酮、2，5-二甲基吡嗪（Jemioloet al.，1994）；雪貂Mustela furo的尿液中含有 2-庚酮、4-庚酮、2，5-二甲基吡嗪、壬醛等成分（Zhanget al.，2005）；2，5-二甲基吡嗪在花鼠Eutamias sibiricus的尿液中存在顯著的性別差異，可能是花鼠的性信息素（王瑤等，2016）；獅子的尿液中含有2-壬酮、壬醛（Soso&Koziel，2017）。

高原鼠兔尿液中2，5-二甲基吡嗪的含量較高，且在不同性別中的含量差異顯著。Zhang 等（2005）發(fā)現(xiàn)雄性雪貂尿液中的3 種主要成分（喹啉、2，5-二甲基吡嗪、4-庚酮）能夠抑制雄性小鼠的嗅探行為。2，5-二甲基吡嗪能夠延緩雌性小鼠發(fā)情時間，繁殖成功率降低34%，幼鼠死亡率升高（Jemiolo & Novotny，1993）。2，5-二甲基吡嗪顯著提高了小鼠精子的變異頻率，抑制了雄性的生殖功能（Daev，2003；Daev & Dukel'Skaia，2003）。2，5-二甲基吡嗪是刺激雄性小家鼠產(chǎn)生Lee-Boot效應(yīng)的主要作用成分（Maet al.，1998）。綜上，本研究中2，5-二甲基吡嗪對雌性高原鼠兔有顯著的引誘效果，推測其可能是高原鼠兔的性信息素。在后續(xù)的研究中，可以分析高原鼠兔在發(fā)情期與非發(fā)情期、不同年齡階段的尿液中2，5-二甲基吡嗪的差異，并結(jié)合高原鼠兔的行為觀察、誘捕試驗驗證2，5-二甲基吡嗪的引誘活性。

附錄Supplementary material

附表1 高原鼠兔雌雄尿液揮發(fā)性成分

Appendix 1 Volatile compounds in urines of female and maleOchotona curzoniae（http：//www.scdwzz.com/Articles/fujian20220108-1.pdf）