君子蘭細(xì)菌性葉枯病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選1)

趙麗娜 朱洪坤 吳欣航 張爽 范文忠 崔娟

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林省·吉林市，132101)

君子蘭(Cliviaminiata)屬于石蒜科(Amaryllidaceae)君子蘭屬(Clivia)多年生草本植物，花、葉子和果實(shí)都具有很高的觀賞價(jià)值[1]。君子蘭在世界各地廣為栽培，是全球最重要的觀賞花卉之一，備受人們的喜愛。然而君子蘭在養(yǎng)殖的過程中常易發(fā)生病害，例如炭疽病、白絹病、葉斑病、軟腐病、灰斑病、黃葉病等都是比較常見的主要病害[2]。2019年夏，在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院溫室大棚中發(fā)現(xiàn)一種君子蘭新病害——葉枯病，其發(fā)病率為25%～60%。發(fā)病部位主要為中下部葉片，從葉片邊緣開始變褐，然后逐漸枯萎?dāng)U大，發(fā)病較重，嚴(yán)重影響君子蘭的生長與觀賞。該病害在我國屬首次發(fā)現(xiàn)，未見系統(tǒng)報(bào)道和相關(guān)研究。為明確君子蘭葉枯病的病原歸屬，本文對該病原菌進(jìn)行分離純化、致病性測定，根據(jù)病原細(xì)菌的表型特征和分子鑒定，明確引起君子蘭葉枯病的病原種類；并通過對君子蘭葉枯病的藥劑篩選研究，為該病害的防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

供試植物：君子蘭正常植株和病株均來源于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院溫室大棚。

供試NA液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g，加入蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH7.0～7.2；NA固體培養(yǎng)基，在上述配方的基礎(chǔ)上加入15 g瓊脂。以上2種培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min后用于病原菌的分離、純化及培養(yǎng)。

供試藥劑：20%噻菌銅懸浮劑，浙江龍灣化工有限公司；30%乙蒜素乳油，河南中威春雨植物營養(yǎng)有限公司；0.3%四霉素水劑，遼寧微科生物工程股份有限公司；3%中生菌素可濕性粉劑，華北制藥河北華諾有限公司；40%三氯異氰尿酸可濕性粉劑，湖南神隆海洋生物工程有限公司；70%堿式硫酸銅水分散粒劑，海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；46%氫氧化銅水分散粒劑，美國杜邦公司；85%波爾·甲霜靈可濕性粉劑、77%硫酸銅鈣可濕性粉劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司；6%春雷霉素，山東利邦農(nóng)化有限公司。

1.1 試驗(yàn)方法

病害癥狀觀察。2019年夏在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院溫室大棚中，采集具有君子蘭葉枯病典型癥狀的患病葉片，觀察并記錄病害癥狀。

病原菌的分離與純化。選取發(fā)病部位的葉片，按照方中達(dá)[3]方法進(jìn)行病原菌的分離。剪取葉片病健交界處，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒30～60 s，然后用無菌水沖洗3次，放入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)并將病組織剪碎，加入少量的無菌水，靜止10 min，制成菌懸液。用接種環(huán)蘸取菌懸液在NA培養(yǎng)基上劃線，然后將平板置于相對濕度65%、12 h光照/12 h黑暗、恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24～48 h，長出單菌落后用接菌環(huán)挑取性狀一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化，純化后的菌株用80%甘油于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

致病性測定。依據(jù)柯赫氏法則[4]進(jìn)行致病性測定。在5 mL的NA液體培養(yǎng)基中加入代表性菌株單菌落，并于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，加入適量無菌水配成體積為1×108CFU/mL的細(xì)菌懸浮液，備用。葉片采用針刺噴霧法，在噴霧前，君子蘭葉片采用75%乙醇進(jìn)行表面擦拭消毒，然后用無菌針將君子蘭葉片造成微傷口，取0.5 mL菌懸液噴到葉片上，重復(fù)3次，用等量的無菌水作對照，接種完成后28 ℃保濕培養(yǎng)，3 d后開始觀察發(fā)病情況。如果從接種發(fā)病的葉片上分離出相同的病原菌，則證明該菌株具有致病性。

病原菌菌落形態(tài)、生理生化試驗(yàn)。取代表性菌株在NA培養(yǎng)基中劃線后于相對濕度65%、12 h光照/12 h黑暗、恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng)24 h，長出菌落后觀察菌落特征，主要包括形狀、顏色、大小、光澤、表面狀況、邊緣、透光性、隆起度以及是否產(chǎn)生色素等。菌株部分生理生化試驗(yàn)具體方法按照方中達(dá)等常規(guī)方法[3，5-6]進(jìn)行。

病原菌分子鑒定。采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]。擴(kuò)增體系為25 μL：PCR Master Mix 2×12.5 μL，DNA模板100 mg·L-11 μL，上游和下游引物均為10 mmol·L-1各0.5 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送到上海生工生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列進(jìn)行BLAST比對，確定其分類地位。選擇高相似性序列，用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining[8]法生成系統(tǒng)發(fā)育樹，MEGA 7.0軟件的使用方法與MEGA 4.0相同[9]。

病原菌對藥劑的敏感性。本試驗(yàn)采用抑菌圈法，將代表性菌株制成體積為1×106CFU/mL的菌懸液，NA液體培養(yǎng)基冷卻到45～50 ℃時(shí)，將菌懸液按照體積比1∶20的比例加入其中，混勻后再倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固。用無菌鑷子分別夾取3片單層無菌濾紙片(直徑為6 mm)以等邊三角形的排列方式放入到已凝固的含菌NA固體培養(yǎng)基中。將不同藥劑配置成5個(gè)質(zhì)量濃度，20%噻菌銅懸浮劑：200、400、600、800、1 000 mg·L-1；30%乙蒜素乳油：200、400、600、800、1 000 mg·L-1；0.3%四霉素水劑：1 500、2 500、4 000、5 000、10 000 mg·L-1；3%中生菌素可濕性粉劑：1 000、2 000、2 500、4 000、5 000 mg·L-1；46%氫氧化銅水分散粒劑：2 500、5 000、6 000、10 000、20 000 mg·L-1；其他藥劑：1 000、2 500、5 000、7 500、10 000 mg·L-1。用移液槍分別移取10 μL不同質(zhì)量濃度的藥液滴加到濾紙片上，每種藥劑3次重復(fù)。滴加10 μL無菌水的濾紙片為對照，然后將培養(yǎng)皿放入相對濕度65%、12 h光照/12 h黑暗、恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)1 d，用十字交叉法測量各處理的抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率。以藥劑質(zhì)量濃度數(shù)值為自變量x，抑菌率的概率值為因變量y，建立毒力回歸方程，通過毒力回歸方程計(jì)算各藥劑半致死質(zhì)量濃度[10-11]。

抑菌率=[(處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑)/處理抑菌圈直徑]×100%。

1.2 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用DPS(v14.1)軟件進(jìn)行毒力回歸方程數(shù)據(jù)分析，建立毒力回歸方程，并求出各藥劑的半致死質(zhì)量濃度及相關(guān)系數(shù)r，比較不同藥劑的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害癥狀

君子蘭葉枯病主要癥狀為：從葉片邊緣開始變褐，然后逐漸枯萎?dāng)U大，發(fā)病部位主要為中下部葉片，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)60%，影響植物的生長與觀賞(圖1)。

A.發(fā)病初期；B.發(fā)病后期。圖1 君子蘭發(fā)病葉片

2.2 致病性

采用平板劃線分離法對新鮮病組織進(jìn)行分離和純化后共獲得培養(yǎng)性狀一致的10株菌株，分別編號為JZL01～JZL10，本試驗(yàn)選取了代表性菌株JZL01進(jìn)行了致病性測定。結(jié)果表明，接種后第7天，接種的君子蘭葉片明顯變褐色(圖2A)；接種后第14天，病斑顏色轉(zhuǎn)為深褐色，并逐漸枯萎?dāng)U大(圖2B)，發(fā)病癥狀與田間癥狀基本一致；而對照植株未觀察到發(fā)病癥狀(圖2C～D)。對接種發(fā)病部位進(jìn)行病原菌再分離，經(jīng)形態(tài)觀察及分子序列分析證實(shí)與原接種菌株一致。

A.接種JZL01菌株7 d后的癥狀;B.接種JZL01菌株14 d后的癥狀;C.接種無菌水7 d后的癥狀;D.接種無菌水14 d后的癥狀。圖2 分離菌株對君子蘭離體葉片的致病性測定

2.3 病原菌的特征

菌落形態(tài)：在NA培養(yǎng)基上生長24～48 h后，菌株形成白色半透明的菌落(圖3)，表面粗糙，扁干，邊緣不規(guī)則，最適培養(yǎng)溫度為28 ℃。生理生化結(jié)果見表1，分離菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果與蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)特征基本一致。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)測定和16S rDNA序列比對鑒定，菌株JZL01～JZL10為同一菌株?；?6S rDNA基因序列，構(gòu)建菌株JZL01和相關(guān)參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，菌株JZL01與B.cereus菌株MN746166同在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支上，菌株JZL01與上述菌株16S rDNA序列相似性為100%。根據(jù)上述對JZL01菌株的生理生化鑒定、菌的形態(tài)特征以及16S rDNA序列同源性分析結(jié)果，將分離得到的菌株鑒定為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)。

A.正面;B.背面。圖3 君子蘭葉枯病分離菌株的形態(tài)特征

表1 君子蘭葉枯病分離菌株生理生化測定結(jié)果

2.5 病原菌對藥劑的敏感性

在10種藥劑中，20%噻菌銅懸浮劑和30%乙蒜素乳油對菌株JZL01的半致死質(zhì)量濃度最小，分別為715.30和941.96 mg·L-1；0.3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑、40%三氯異氰尿酸可濕性粉劑和70%堿式硫酸銅水分散粒劑對菌株JZL01的半致死質(zhì)量濃度較小，分別為1 716.33、2 103.18、2 227.82和2 855.10 mg·L-1；46%氫氧化銅水分散粒劑、85%波爾·甲霜靈可濕性粉劑、6%春雷霉素水劑和77%硫酸銅鈣可濕性粉劑對菌株JZL01的半致死質(zhì)量濃度最大，分別為4 913.33、5 693.91、9 905.99和10 684.33 mg·L-1(表2)，表明20%噻菌銅懸浮劑和30%乙蒜素乳油可作為防控該病害的首選藥劑(圖5)。

圖4 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的JZL01菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

A～E.藥劑對病原菌的抑菌效果;F.對照。圖5 病原菌對藥劑的敏感性試驗(yàn)

表2 供試藥劑對Bacillus cereus的室內(nèi)毒力測定

3 結(jié)論與討論

本研究首次報(bào)道了在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院溫室大棚中發(fā)現(xiàn)君子蘭葉枯病，該病害是在君子蘭上新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌性病害，經(jīng)生理生化特性分析和16S rDNA鑒定，該病病原菌為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)。

有研究表明，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)能引起梨樹花芽和葉片枯萎[12]，引起芒果葉枯病[13]，影響生姜生長[14]；環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)能使椰棗幼苗致病[15]；巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)能引起小麥白斑病[16]；蠟樣芽孢桿菌能感染黃瓜、大蒜、辣椒、馬鈴薯等蔬菜[17-18]，感染藍(lán)莓引起藍(lán)莓葉枯病[19]，但還未見蠟樣芽孢桿菌感染君子蘭的報(bào)道。

目前用于細(xì)菌病害防治的藥劑較少，多數(shù)采用銅制劑或者抗生素對病害進(jìn)行防治[20]。本研究選用了10種藥劑進(jìn)行君子蘭葉枯病病原菌的藥劑敏感性測試，其中該病原菌對20%噻菌銅懸浮劑和30%乙蒜素乳油的敏感性較高，有望作為君子蘭葉枯病的田間防治藥劑，但田間防治效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。