無(wú)菌松材線蟲(chóng)對(duì)華北落葉松、油松和馬尾松的致病性1)

方天雨 劉厚言 馮源 陳友梅 葉建仁 朱麗華

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心( 南京林業(yè)大學(xué)) ，南京，210037) (南京林業(yè)大學(xué))

病原研究是疾病和病害研究的基本問(wèn)題。病原確診是揭示致病機(jī)制的前提，也是科學(xué)制定防控措施的基礎(chǔ)。2003年的“非典”事件(嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥，SARS)充分證明病原的準(zhǔn)確鑒定對(duì)防控措施制定的重要性。SARS出現(xiàn)早期，專(zhuān)家將其病原診斷為衣原體，然而大量病例抗生素治療無(wú)效，進(jìn)一步深入研究將SARS病原準(zhǔn)確確定為冠狀病毒。最終，通過(guò)采取針對(duì)病毒的防控策略，該新發(fā)全球流行性疾病的擴(kuò)散傳播才得以有效控制[1-2]。

松材線蟲(chóng)病是一種毀滅性松樹(shù)流行病，不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]，且導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)破壞，堪稱(chēng)松林“SARS”或“新冠肺炎”。目前該病害在美洲[4]、亞洲[5-6]、歐洲[7-8]，以及非洲[9]多國(guó)有分布。北美洲被認(rèn)為是松材線蟲(chóng)病的原發(fā)地[4，10]，亞洲是松材線蟲(chóng)病流行危害最嚴(yán)重的地區(qū)，其中我國(guó)受害尤其嚴(yán)重[11]。自1982年首次在南京發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該病害迅速向中國(guó)南方擴(kuò)散，并逐步向北蔓延，截止2020年，全國(guó)共計(jì)17個(gè)省(區(qū)、市)722個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生松材線蟲(chóng)病(國(guó)家林業(yè)和草原局2021年第5號(hào)公告)；其在我國(guó)自然感染的樹(shù)種也從松屬(Pinusspp.)跨越到了落葉松屬(Larixspp.)，包括黑松(P.thunbergii)、赤松(P.densiflora)、馬尾松(P.massoniana)、油松(P.tabuliformis)、紅松(P.koraiensis)、樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica)、長(zhǎng)白落葉松(L.olgensis)、日本落葉松(L.kaempferi)、華北落葉松(L.principis-rupprechtii)等17個(gè)松種[11-14]。松材線蟲(chóng)病的發(fā)生涉及多個(gè)生物因子[15]，病害系統(tǒng)相當(dāng)復(fù)雜[16]。雖然該病害最早于1905年在日本首次報(bào)道，但直到1971年，松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)才被鑒定為該病害的病原[17]。隨后，有學(xué)者提出松樹(shù)快速萎蔫與松材線蟲(chóng)攜帶細(xì)菌產(chǎn)生的毒素有關(guān)[18]，有學(xué)者進(jìn)一步報(bào)道不攜帶任何細(xì)菌的松材線蟲(chóng)失去了對(duì)松苗的致病性[19-20]，無(wú)菌松材線蟲(chóng)或致病力相對(duì)弱的擬松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusmucronatus)與致病細(xì)菌共同接種則導(dǎo)致松苗萎蔫[21-23]，因此，認(rèn)為松材線蟲(chóng)伴生細(xì)菌才是該病害的真正病原[21-22]，也有學(xué)者提出松萎蔫病是松材線蟲(chóng)與細(xì)菌共同侵染引起的復(fù)合侵染病害[23]。然而，有些研究則顯示，無(wú)菌松材線蟲(chóng)并未失去其對(duì)松苗的致病性[24-28]。由于松材線蟲(chóng)病病原尚未徹底弄清，致病機(jī)制也不十分清楚[10，16]，導(dǎo)致防控措施上也存在一定混亂。目前采取的主要防控措施有檢疫和疫情監(jiān)測(cè)、疫木除治、媒介昆蟲(chóng)防治，以及針對(duì)病原松材線蟲(chóng)的樹(shù)干注射[11]；此外，也有針對(duì)細(xì)菌作為病原的防控措施[29-30]。為了進(jìn)一步明確松材線蟲(chóng)病的病原問(wèn)題，本研究以華北落葉松、油松和馬尾松無(wú)菌苗為試驗(yàn)材料，探討了無(wú)菌松材線蟲(chóng)的致病性，以期為病害致病機(jī)制研究及防控策略制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

供試松材線蟲(chóng)為強(qiáng)致病力蟲(chóng)株AMA3c1經(jīng)無(wú)菌化處理獲得的不攜帶細(xì)菌的松材線蟲(chóng)(簡(jiǎn)稱(chēng)無(wú)菌松材線蟲(chóng))，使用前于冰箱4 ℃保存[27]。致病性測(cè)定試驗(yàn)開(kāi)始前15 d，將無(wú)菌松材線蟲(chóng)從冰箱取出，接種于生長(zhǎng)旺盛的馬尾松愈傷組織上，培養(yǎng)10 d后于無(wú)菌條件下分離獲得線蟲(chóng)懸液，取0.5 mL線蟲(chóng)懸液于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)5 d，檢驗(yàn)無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)后，用于后續(xù)致病性測(cè)定試驗(yàn)。

供試馬尾松成熟種子采集自廣東信宜(2019年)、油松成熟種子采集自河北承德平泉(2017年)、華北落葉松成熟種子采集自河北圍場(chǎng)(2017年)。所有種子，使用前于冰箱4 ℃條件下保存。

無(wú)菌松苗的制備：于超凈工作臺(tái)中，將無(wú)菌水沖洗1 h后的馬尾松、油松和華北落葉松種子分別放入下端四周及底部戳有小孔(孔徑小于種子)的滅菌50 mL離心管內(nèi)，將離心管浸入裝有75%酒精的滅菌100 mL燒杯中，浸泡30 s后取出，排盡酒精后將離心管轉(zhuǎn)入裝有30% H2O2的滅菌燒杯中浸泡20 min，期間不時(shí)用滅菌鑷子攪動(dòng)種子以保證充分滅菌，待滅菌結(jié)束，將離心管取出，無(wú)菌水沖洗直至干凈(持續(xù)2～3 min)，將滅菌后種子置于滅菌濾紙上，待種子表面干燥后，將種子間隔接種于水瓊脂平板上，10粒/皿，25 ℃，暗培養(yǎng)。每次處理種子300粒左右，試驗(yàn)重復(fù)3次。7 d后統(tǒng)計(jì)其污染率及萌發(fā)率。14 d后將無(wú)菌萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)入裝有40 mL DCR+30 g/L蔗糖+活性炭1.0 g/L的培養(yǎng)基中(pH=5.8)[25]，25 ℃，光照培養(yǎng)，備用。

無(wú)菌松材線蟲(chóng)對(duì)華北落葉松、油松和馬尾松的致病性測(cè)定及線蟲(chóng)的再分離：無(wú)菌松材線蟲(chóng)的致病性測(cè)定參照朱麗華等[31]的方法，即截頂法。于超凈工作臺(tái)中將無(wú)菌松苗取出，用滅菌手術(shù)刀截去頂端分生組織，再將松苗重新種植于新鮮培養(yǎng)基中，將一滅菌棉球置于松苗頂端傷口處，隨后用移液器將50 μL無(wú)菌松材線蟲(chóng)懸液(約含線蟲(chóng)500條)接種于小棉球上，每個(gè)松種接種10～20株苗，以接等體積無(wú)菌水為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次。接種后，將松苗置于(25±2)℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察松苗萎蔫情況，統(tǒng)計(jì)松苗萎蔫率，即萎蔫率=(萎蔫植株數(shù)/接種植株數(shù))×100%。

接種25 d后，對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行線蟲(chóng)的再分離，每個(gè)松種分離6～10株。于超凈臺(tái)中，將松苗取出，用手術(shù)剪將其剪成若干5 mm左右小段，采用貝爾曼漏斗法進(jìn)行線蟲(chóng)再分離，24 h后收集線蟲(chóng)懸液，并對(duì)再分離線蟲(chóng)進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)；顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)數(shù)量，計(jì)算每株松苗中的線蟲(chóng)數(shù)量。

采用GraphPadPrism6.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 30% H2O2對(duì)華北落葉松、油松和馬尾松成熟種子無(wú)菌化及其萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，30% H2O2處理3種松樹(shù)種子均能夠取得較好的滅菌效果，其中馬尾松和華北落葉松平均污染率均低于5%，油松污染率稍高，平均污染率為7.6%；不同松種之間種子萌發(fā)率有一定差異，由高到低依次為馬尾松、華北落葉松和油松，其無(wú)菌萌發(fā)率平均分別為67.7%、60.1%和47.5%(表1)。經(jīng)30% H2O2處理的松種在無(wú)菌條件下萌發(fā)、發(fā)育正常(圖1)。

表1 30% H2O2處理時(shí)3種松樹(shù)種子的無(wú)菌萌發(fā)

2.2 無(wú)菌松材線蟲(chóng)對(duì)華北落葉松、油松和馬尾松的致病性

接種6 d后，首先觀察到馬尾松苗針葉褪色，隨著時(shí)間推移，針葉黃化最后變成紅褐色，萎蔫癥狀與野外發(fā)病癥狀一致(圖2A)；油松和華北落葉松表現(xiàn)發(fā)病癥狀較馬尾松晚，均于第12天出現(xiàn)針葉褪色、黃化現(xiàn)象，最后亦變成紅褐色(圖2B、C)，油松和華北落葉松針葉變紅褐色的時(shí)間進(jìn)程與馬尾松相比，相對(duì)更慢。接種無(wú)菌松材線蟲(chóng)的馬尾松和油松發(fā)病率相對(duì)較高，25 d后，其平均萎蔫率分別為89.2%和78.3%，而華北落葉松苗平均萎蔫率為53.3%(表2)。接種無(wú)菌水的對(duì)照松苗始終保持健康狀態(tài)(圖2D～F)。

A.萌發(fā)7 d；B.萌發(fā)14 d。圖1 無(wú)菌萌發(fā)的馬尾松成熟種子

A～C.馬尾松、油松和華北落葉松接種無(wú)菌松材線蟲(chóng)(25 d后)；D～F.對(duì)照馬尾松、油松和華北落葉松(無(wú)菌水接種)。圖2 無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種馬尾松、油松和華北落葉松的發(fā)病癥狀

表2 無(wú)菌松材線蟲(chóng)對(duì)馬尾松、油松和華北落葉松的致病性及再分離線蟲(chóng)數(shù)量

2.3 萎蔫植株中再分離線蟲(chóng)的數(shù)量

接種25 d后，線蟲(chóng)再分離結(jié)果表明，無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種發(fā)病的松苗中均分離到了松材線蟲(chóng)，馬尾松和油松萎蔫植株中再分離的線蟲(chóng)數(shù)量高于華北落葉松；同一松種內(nèi)，不同植株間再分離線蟲(chóng)數(shù)量差異較大(表2)。馬尾松萎蔫植株中再分離線蟲(chóng)數(shù)量平均為(2 628±3 321)條/株(N=6株)，單株最低線蟲(chóng)數(shù)量為400條，最高達(dá)9 267條；油松萎蔫植株中再分離線蟲(chóng)數(shù)量平均為(2 627±2 287)條/株(N=10株)，單株最低線蟲(chóng)數(shù)量為133條，最高達(dá)6 800條；華北落葉松萎蔫植株中再分離線蟲(chóng)數(shù)量平均為(1 144±608)條/株(N=6株)，單株最低線蟲(chóng)數(shù)量為433條，最高為1 900條(表2)。經(jīng)LB液體培養(yǎng)基檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)有任何細(xì)菌生長(zhǎng)。

3 討論

自從Mamiya et al.[17]1971年首次將松材線蟲(chóng)鑒定為該病害的病原，已經(jīng)過(guò)去了整整50 a。期間，松材線蟲(chóng)在松樹(shù)萎蔫過(guò)程中的作用、及作為唯一病原引起松樹(shù)萎蔫的能力和松材線蟲(chóng)攜帶細(xì)菌在松樹(shù)萎蔫過(guò)程中的地位，一直倍受關(guān)注。為了準(zhǔn)確界定松材線蟲(chóng)及其攜帶細(xì)菌在該復(fù)雜病害系統(tǒng)中的作用，多項(xiàng)研究對(duì)無(wú)菌松材線蟲(chóng)的致病性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果不盡相同。

早在1977年，Tamura[32]發(fā)現(xiàn)無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種赤松可致其萎蔫，萎蔫率與帶菌松材線蟲(chóng)無(wú)異；且在石蠟油中保存1 a后的無(wú)菌松材線蟲(chóng)依然保持致病性。Bolla et al.[33]亦報(bào)道，無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種歐洲赤松(P.sylvestris)可導(dǎo)致其萎蔫，其程度與帶菌松材線蟲(chóng)接種相同。1983年，Tamura[24]進(jìn)一步證實(shí)無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種可致無(wú)菌黑松苗及3年生盆栽赤松苗萎蔫。近年來(lái)，多位研究者采用無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種馬尾松和赤松[25，27]、海岸松(P.pinaster)[34]、黑松[26]、地中海松(P.halepensis)[35]，均獲得相同的結(jié)果，證明松材線蟲(chóng)作為唯一病原，可以引起松樹(shù)萎蔫，松材線蟲(chóng)攜帶細(xì)菌并非松樹(shù)萎蔫的必需因子。本研究中，無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種可導(dǎo)致華北落葉松、油松和馬尾松無(wú)菌苗萎蔫。

然而，Kawazu et al.[19]的研究結(jié)果顯示，無(wú)菌松材線蟲(chóng)單獨(dú)接種未能引起赤松苗萎蔫，即無(wú)菌化處理使松材線蟲(chóng)失去了致病性[21]。隨后，郭道森等[20]也報(bào)道，無(wú)菌松材線蟲(chóng)單獨(dú)接種不能使黑松苗發(fā)病，與細(xì)菌混合接種卻可使松苗萎蔫。洪英娣等[36]以及Han et al.等[22]進(jìn)一步證實(shí)，無(wú)菌松材線蟲(chóng)單獨(dú)接種不能使松苗發(fā)病，但若與松材線蟲(chóng)攜帶細(xì)菌混合接種則均能導(dǎo)致松苗萎蔫；并且，弱致病力擬松材線蟲(chóng)與細(xì)菌混合接種后引起了松苗嚴(yán)重萎蔫，因此認(rèn)為松苗萎蔫由松材線蟲(chóng)攜帶細(xì)菌種類(lèi)所決定，而與線蟲(chóng)種類(lèi)不大。此后，也有學(xué)者報(bào)道不攜帶細(xì)菌的松材線蟲(chóng)對(duì)黑松沒(méi)有致病性[23，37-38]。雖然Kawazu et al.[19]無(wú)菌條件下的接種結(jié)果顯示無(wú)菌OKD-3失去了致病性，但其開(kāi)放條件下的接種結(jié)果卻表明無(wú)菌OKD-3依然能導(dǎo)致非無(wú)菌赤松苗的枯萎。對(duì)此，Kawazu et al.[19]認(rèn)為，由于在開(kāi)放條件下接種，使無(wú)菌松材線蟲(chóng)重新感染了具有致病性的細(xì)菌，因此使其重新獲得了致病性。

綜上所述，有多項(xiàng)研究證實(shí)無(wú)菌松材線蟲(chóng)對(duì)6種松屬樹(shù)種，即歐洲赤松、黑松、赤松、馬尾松、海岸松、地中海松具有致病性；同樣也有多項(xiàng)試驗(yàn)表明無(wú)菌化處理使松材線蟲(chóng)失去了致病性，其間的差異可能與試驗(yàn)所用的蟲(chóng)株有關(guān)，也可能與其他因素，例如致病性測(cè)定所用接種方法及觀察時(shí)間等有關(guān)。本研究于無(wú)菌條件下對(duì)無(wú)菌松苗進(jìn)行無(wú)菌松材線蟲(chóng)接種，再次證實(shí)，無(wú)菌松材線蟲(chóng)不僅對(duì)松屬樹(shù)種有致病性，對(duì)落葉松屬樹(shù)種同樣具有致病性。今后應(yīng)采用更多蟲(chóng)株、更多松種、更統(tǒng)一的方法在完全無(wú)菌的條件下進(jìn)行接種，以充分評(píng)估松材線蟲(chóng)及其攜帶細(xì)菌在松樹(shù)萎蔫過(guò)程中的作用。

4 結(jié)論

再次證實(shí)無(wú)菌化處理的松材線蟲(chóng)并未失去對(duì)松屬樹(shù)種的致病性，同時(shí)對(duì)落葉松屬樹(shù)種同樣具有致病性。因此，松材線蟲(chóng)是導(dǎo)致松樹(shù)萎蔫的真正原因，其致病性與其伴生細(xì)菌無(wú)關(guān)，并且其危害致病的樹(shù)種范圍也進(jìn)一步擴(kuò)大。