清膚消腫散調(diào)控急性皮下蜂窩組織炎大鼠TGF-β1Smad信號(hào)通路的研究*

文 波 李 琦

四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 610500

蜂窩組織炎是細(xì)菌局部感染或病變侵害導(dǎo)致的化膿性感染，表現(xiàn)為局部的紅、腫、熱、痛以及快速擴(kuò)散[1]。大量研究顯示其在中老年人中最常發(fā)生，其致病菌最常見的是溶血性鏈球菌。急性皮下蜂窩組織炎的特點(diǎn)主要是突然發(fā)病、發(fā)展迅速與病程兇險(xiǎn)，如果不能得到及時(shí)有效的治療，易導(dǎo)致一系列嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。目前臨床對(duì)于蜂窩組織炎的治療主要以綜合治療為主，包括給予營(yíng)養(yǎng)支持、維持機(jī)體水電解質(zhì)平衡、改善機(jī)體低蛋白血癥及抗生素治療[3]。近些年來(lái)中醫(yī)臨床對(duì)于急性皮下蜂窩組織炎的治療也在逐步發(fā)展，清膚消腫散是我院治療急性皮下蜂窩組織炎的臨床經(jīng)驗(yàn)組方，但對(duì)于其治療作用機(jī)制尚未得出清晰認(rèn)識(shí)。研究顯示，TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著減輕組織損傷，且在急性皮下蜂窩組織炎的發(fā)展過程中TGF-β1水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此本研究以TGF-β1/Smads信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討清膚消腫散治療對(duì)于急性皮下蜂窩組織炎的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠45只，清潔級(jí)，體重(220±20)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為Ⅱ級(jí)，光照周期12h/12h，室溫在22～25℃之間，相對(duì)濕度為45%～60%，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 清膚消腫散為本院自制；ELISA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；SYBR Green染料購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol Reagent總 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)英杰公司；TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7以及β-actin抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組：將SD大鼠45只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組與研究組，每組15只。其中正常對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)，模型對(duì)照組與研究組建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型。模型制備后研究組大鼠給予清膚消腫散外敷治療。治療1周后處死所有大鼠并取皮下組織制備樣本，保存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 造模方法：每只SD大鼠通過向右旁腹上方皮膚注射0.2ml G族鏈球菌懸液以建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型。

1.3.3 治療方法：當(dāng)模型制備成功1d后，研究組大鼠給予清膚消腫散在皮下蜂窩組織炎患處外敷治療，2次/d。用藥3d，共6次。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 通過ELISA檢測(cè)各組大鼠外周血中TGF-β1、IL-8和TNF-α水平：取出部分大鼠皮下組織，以25ml/g加入生理鹽水混合研磨后離心分離上清液，按照ELISA試劑盒步驟對(duì)樣本TGF-β1、IL-8和TNF-α進(jìn)行標(biāo)記，測(cè)量吸光度后以標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算其中TGF-β1、IL-8和TNF-α的含量。

1.4.2 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平：取出部分大鼠皮下組織，將其置于液氮中磨碎，加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理，隨后進(jìn)行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用。取制備好的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7及β-actin上下游引物混合，隨后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增并定量分析。上述引物序列見表1。

表1 所選基因引物序列

1.4.3 Western Blot法檢測(cè)各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白水平：取出部分大鼠皮下組織，通過組織破碎儀加蛋白提取試劑提取總蛋白，將提取的蛋白加入十二烷基磺酸鈉混勻后水煮變性。將提取的總蛋白進(jìn)行電泳、封閉及轉(zhuǎn)膜操作。轉(zhuǎn)膜后分別孵育TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7及β-actin抗體與相對(duì)應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，洗膜顯影，結(jié)果用ImageJ軟件對(duì)各組細(xì)胞中不同因子的相對(duì)灰度值進(jìn)行系統(tǒng)性分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血中炎癥指標(biāo)水平 ELISA結(jié)果如表2所示，造模后模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，其血清TGF-β1、IL-8和TNF-α水平顯著上升(P<0.05)，提示皮下蜂窩組織炎可使相關(guān)的炎癥因子表達(dá)水平增加；與模型對(duì)照組相比，研究組大鼠血清中TGF-β1、IL-8和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠上皮組織TGF-β1、IL-8和TNF-α水平

2.2 各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平 RT-PCR結(jié)果如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA水平均顯著升高，Smad7的mRNA水平均明顯降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，研究組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA水平均顯著降低，Smad7水平顯著上升(P<0.05)。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)中EPO、VEGF的mRNA水平

2.3 各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白變化水平 Western Blot結(jié)果如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白水平均顯著升高，Smad7水平均明顯降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，研究組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白水平均顯著降低，Smad7水平顯著上升 (P<0.05)。

圖2 各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平

3 討論

急性皮下蜂窩組織炎最常見的癥狀為皮下組織炎性病變并化膿，其致病菌多為金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌。這一類致病菌能夠崩解基質(zhì)與溶解纖維素并且由于皮下組織疏松及筋膜間隙較多，使得感染迅速蔓延，并伴有中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。如果沒有得到及時(shí)有效的治療用于控制病情，往往會(huì)導(dǎo)致病灶出現(xiàn)紅腫熱痛等情況。隨著病情的持續(xù)發(fā)展，組織壞死形成囊腫，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致膿毒血癥及其他嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致預(yù)后較差。因此合適的治療方案是臨床需要解決的問題，近些年中醫(yī)藥在臨床診治急性皮下蜂窩組織炎表現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4-5]。

清膚消腫散是我院臨床經(jīng)驗(yàn)方，在明代經(jīng)方的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代中西醫(yī)理論的創(chuàng)新，經(jīng)過加減后配伍組成，方內(nèi)主要成分為黃連、紫花地丁、梔子、蒲公英、連翹與金銀花。前期臨床使用顯示，該藥可能具有改善患者急性皮下蜂窩組織炎癥狀功效。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)成功建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型后大鼠外周血中炎癥因子IL-8與TNF-α顯著上升，與其他研究一致，且TGF-β1水平同樣上升。當(dāng)給予清膚消腫散治療后，其炎癥水平得到了顯著改善，而且TGF-β1水平同樣得到了降低。這可能與清膚消腫散方中成分效果有關(guān)。其中黃連和紫花地丁有苦泄、辛散，涼血消腫的效果[6]，能改善患處炎癥水平；梔子、蒲公英、連翹和金銀花分別發(fā)揮消腫止痛、涼血解毒[7-8]的效果；多藥共奏清熱涼血的作用，從而改善患者體內(nèi)炎癥水平及患處癥狀。此外，清膚消腫散是我院專家在明代經(jīng)方基礎(chǔ)上結(jié)合臨床應(yīng)用改良而來(lái)，效果顯著。前期臨床研究顯示，在使用清膚消腫散治療的患者中，其TGF-β1水平與癥狀嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

TGF-β1/Smad 信號(hào)通路是一條經(jīng)典的分子信號(hào)通路，研究表明，TGF-β1 的生物學(xué)效應(yīng)主要通過Smad 家族蛋白發(fā)揮，主要包括該蛋白質(zhì)家族中的受體調(diào)節(jié)型蛋白Smad2、Smad3和抑制型蛋白Smad 7型[9-10]。TGF-β1 經(jīng)整合素、蛋白酶等機(jī)制激活后可與細(xì)胞表面的跨膜受體Ⅱ結(jié)合，并在磷酸化作用下活化 Smad2、Smad3蛋白，繼而進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的合成[11]。但是，當(dāng) Smad7 上調(diào)并與跨膜受體Ⅰ結(jié)合時(shí)，Smad2、Smad3 活化會(huì)受到抑制[12]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)成功建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型后，其皮下組織中TGF-β1與其下游受體調(diào)節(jié)蛋白Smad2、Smad3顯著升高，抑制型蛋白Smad7顯著降低，說明TGF-β1/Smad信號(hào)通路在這一過程中發(fā)揮著重要作用，而給予清膚消腫散治療后能夠明顯拮抗這一效應(yīng)，提示清膚消腫散能夠通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，本研究通過建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型，并給予清膚消腫散治療，能夠顯著改善大鼠炎癥水平，這一過程很可能與抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路有關(guān)。