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    高原蕁麻總黃酮提取工藝及含量分析*

    2022-11-28 13:01:46黃國(guó)梁宗和坤左昆明韓興昊
    西藏科技 2022年8期
    關(guān)鍵詞:蕁麻濃縮液石油醚

    黃國(guó)梁 宗和坤 左昆明 韓興昊

    (西藏農(nóng)牧學(xué)院公共教學(xué)部,西藏 林芝 860000)

    高原蕁麻,為高寒地帶植物,耐寒、耐瘠,抗逆性強(qiáng),一般生長(zhǎng)在海拔4200~5000m,但也有部分分布在2000m左右,多產(chǎn)于西藏雅魯藏布江沿岸,四川、新疆、青海等地也有分布。其為一年生、多年生野本植物,自然生長(zhǎng)在草叢和原始森林中。高原蕁麻生長(zhǎng)條件較為苛刻,低海拔植株生長(zhǎng)較為分散[1]?,F(xiàn)代藥理學(xué)表明該植物含有黃酮類(lèi)、木質(zhì)素類(lèi)、香豆素類(lèi)等有效成分,具有很好的抗炎止痛、皮膚瘙癢、抗風(fēng)濕等藥理活性。蕁麻在世界上廣泛分布,與艾麻屬(Laportea Gandich)有相似親緣關(guān)系[2],是我國(guó)常用的民間用藥[3,4],其含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素C 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并且在多個(gè)少數(shù)民族中作為豬飼料廣泛使用[5],裂葉蕁麻中的汞、鉛含量均未超過(guò)蔬菜的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn),屬于可食安全范圍[6],可列入保健食品資源之一[7]。國(guó)內(nèi)外對(duì)蕁麻屬植物化學(xué)成分進(jìn)行了大量的研究,結(jié)果表明該植物含有黃酮類(lèi)、甾類(lèi)、香豆素、木脂素、有機(jī)酸等成分[8-10],具有抑制良性前列腺增生、抗風(fēng)濕、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗氧化等藥理活性[11-13],臨床主要用于良性前列腺增生、風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療,療效顯著[14-16]。迄今為止有關(guān)高原蕁麻中總黃酮含量的提取報(bào)道較少[17,18]。文章以高原蕁麻為原料,蘆丁含量為指標(biāo)通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)選擇高原蕁麻中總黃酮提取工藝,為研發(fā)藥物等提供參考。

    1 材料和藥品

    1.1 材料

    高原蕁麻(由西藏林芝市特產(chǎn)店提供)、四川蕁麻,洗凈后擦干,置于105℃下殺青,之后置于70℃下干燥,粉碎備用。

    1.2 儀器

    島津LC-20A 高效液相儀、島津UV-2700 紫外分光光度計(jì)、水浴恒溫鍋、恒溫烘箱、優(yōu)普超純水機(jī)、分析天平。

    1.3 試劑

    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、等均為AR分析純,甲醇(色譜純),實(shí)驗(yàn)用水均為用去離子水。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 蘆丁顯色劑的選用

    結(jié)果表明當(dāng)采用5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、4%氫氧化鈉做顯色劑使用時(shí)顯色效果最佳,但由于顯色穩(wěn)定性較差,固應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用[19]。

    2.2 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的蘆丁試劑標(biāo)準(zhǔn)品10mg,加入70%乙醇溶解,定容至100mL容量瓶中,搖勻,稱(chēng)作標(biāo)樣0,備用。

    2.3 最大吸收峰的測(cè)定

    吸取2.2 中的對(duì)照溶液0.00mL、2.5mL 置于10mL具塞量筒,加入70%乙醇溶液至5mL,之后加入5%亞硝酸鈉0.3mL,放置6min 再加入10% 硝酸鋁溶液0.3mL,搖勻,放置6min,之后加入4%氫氧化鈉4mL,之后用水稀釋至10mL,放置15~20min 顯色。之后以0.00mL 為空白,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量400~800nm的吸收曲線(xiàn),確定當(dāng)波長(zhǎng)為415nm 時(shí)有最大吸收峰,固選用415nm處測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

    2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

    用移液槍吸取2.2 中的待測(cè)液,各加70%乙醇至5mL,轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶并編號(hào),之后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL,搖勻,放置6min,再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL,搖勻,放置6min,加4%氫氧化鈉4mL,再用水稀釋至10mL,放置15~20min。待顯色完畢后,吸取1.5mL 待測(cè)液過(guò)0.45μm 微孔濾膜后,進(jìn)行液相分析,得到線(xiàn)性回歸方程y=584.27x+1742.8,R2=0.9990,如圖1。

    圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    2.5 色譜條件

    流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45);柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)415 nm;流速1.0mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

    2.6 提取工藝優(yōu)化

    2.6.1 料液比對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g 五份,放置在圓底燒瓶中,分別加入70%的乙醇5mL、10mL、15mL、20mL、25mL,在65℃連續(xù)回流2h,之后放冷、抽濾之后,回收乙醇,得到不同料液比下的濃縮液,將濃縮液用石油醚脫脂3~5 次,回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分,過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到10mL 時(shí),轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL 容量瓶中,再用70%乙醇定容,得到樣品吸取0.2mL 待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中,按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定,結(jié)果如表1。

    表1 料液比對(duì)提取的影響

    2.6.2 乙醇濃度對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g五份,放置于圓底燒瓶中,分別加入60%、65%、70%、75%、80%的乙醇10mL 在65℃連續(xù)回流2h,之后放冷、抽濾之后,回收乙醇,得到不同料液比下的濃縮液,將濃縮液用石油醚脫脂3~5 次,回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分,過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到4~7mL 時(shí),轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL 容量瓶中,再用70%乙醇定容,得到樣品吸取0.2mL 待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中,按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定,結(jié)果如表2。

    2.6.3 提取溫度對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g五份,放置在圓底燒瓶中,分別加入70%的乙醇15mL,在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃連續(xù)回流2h,之后放冷、抽濾之后,回收乙醇,得到不同料液比下的濃縮液,將濃縮液用石油醚脫脂3~5次,回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分,過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到4~7mL時(shí),轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL容量瓶中,再用70%乙醇定容,得到樣品吸取0.2mL待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,按2.4中的方法和2.5中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定,結(jié)果如表3。

    表3 提取溫度對(duì)提取的影響

    2.6.4 提取時(shí)間對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g五份,放置于圓底燒瓶中,分別加入70%乙醇10mL,在65℃水浴中分別加熱回流1h、1.5h、2h、2.5h、3h 之后放冷、抽濾之后,回收乙醇,得到不同料液比下的濃縮液,將濃縮液用石油醚脫脂3~5 次,回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分,過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到4~7mL 時(shí),轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL 容量瓶中,再用70%乙醇定容,得到樣品吸取0.2mL 待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中,按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定,結(jié)果如表4。

    表4 提取時(shí)間對(duì)提取的影響

    2.6.5 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)因素水平表,見(jiàn)表5,選擇料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間作為考察因素,每個(gè)因素選取3個(gè)水平,以蘆丁含量為指標(biāo)選取最佳工藝。

    表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    2.6.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。高原蕁麻中蘆丁含量提取工藝優(yōu)化3 因素4 水平正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析,見(jiàn)表6,由此可知最佳提取工藝是A2B3C2D2即當(dāng)液料比為1:50,乙醇濃度為70%,浸提時(shí)間為2h。

    表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

    3 高原蕁麻及四川蕁麻中黃酮含量的對(duì)比

    3.1 UV法分析兩種蕁麻黃酮含量

    3.1.1 紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取2.2 中的制備液0.00mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 分別置于10mL 量筒中,各加30%乙醇至5mL,轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶并編號(hào),之后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL,搖勻,放置6min,再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL,搖勻,放置6min,加4%氫氧化鈉4mL,再用水稀釋至10mL,放置15~20min。待顯色完畢后,以0.00mL 為空白,測(cè)定其吸光度,如圖2,得到線(xiàn)性回歸方程y=10.5x -0.487,R2=0.9950。

    圖2 吸光度的線(xiàn)性回歸方程

    3.1.2 紫外儀器精密度測(cè)定。取對(duì)照液1 份,在儀器參數(shù)中設(shè)置測(cè)定次數(shù)為5次,每次測(cè)量間隔為2s(空白不更改),重復(fù)測(cè)試后吸光度RSD為0.1%.

    3.1.3 兩種蕁麻黃酮含量的對(duì)比。分別取1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)樣品,平行稱(chēng)取3 次,按照2.6 方法進(jìn)行提取、定容后,取1mL 待測(cè)液按照2.4 中的方法定容之后進(jìn)入儀器測(cè)定其吸光度,每份樣品平均測(cè)定3 次,取平均值,帶入3.1.1中線(xiàn)性回歸方程計(jì)算總黃酮量,結(jié)果為紫外分光光度計(jì)所測(cè)定的含量見(jiàn)表7。

    表7 紫外分光光度法測(cè)定樣品總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

    3.2 HPLC法分析兩種蕁麻黃酮含量

    采用相同方法處理溶液100μL,用70%乙醇定容至10mL 容量瓶,過(guò)0.45μm濾膜,上機(jī)測(cè)定,測(cè)量峰值帶入2.4中線(xiàn)性回歸方程計(jì)算濃度,HPLC所測(cè)定含量見(jiàn)表8。

    表8 HPLC法測(cè)定樣品總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

    4 結(jié)果與討論

    本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化高原蕁麻中總黃酮的提取工藝,當(dāng)料液比1∶50,乙醇濃度為70%,浸提溫度為60℃,浸提時(shí)間為2h 時(shí),為最優(yōu)提取工藝。通過(guò)對(duì)兩種蕁麻總黃酮含量的測(cè)定,結(jié)果顯示:紫外分光光度法測(cè)定高原蕁麻中總黃酮含量為3.39mg/g 相較于四川蕁麻2.89mg/g 要高出17.30%.高效液相法測(cè)定高原蕁麻中總黃酮含量為3.19mg/g相較于四川蕁麻2.84mg/g要高出12.32%.

    HPLC 測(cè)定高原蕁麻結(jié)果相較紫外測(cè)定結(jié)果普遍偏低,這是由于顯色劑使用堿性鋁離子,其顯色能力隨時(shí)間推移得到減弱,顯色效果在30~90min 內(nèi)最為合適,由于液相測(cè)定所需一定時(shí)間分離后才能通過(guò)uv檢測(cè)器顯示色譜圖,故測(cè)定結(jié)果較紫外結(jié)果偏低且穩(wěn)定性較差,故若使用堿性硝酸鋁作為蘆丁顯色劑時(shí),在條件允許下,應(yīng)選用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其總黃酮含量,結(jié)果較為準(zhǔn)確。若要使用液相色譜進(jìn)行測(cè)定,應(yīng)波長(zhǎng)改為360nm[7]處增強(qiáng)穩(wěn)定性。

    蘆丁為黃酮類(lèi)化合物,具有廣泛的藥理活性和較低的毒性,是天然藥物研究的熱點(diǎn)之一。若蘆丁不加顯色劑,吸收峰在360nm[7]左右,若蘆丁在弱堿性條件下與Al3+發(fā)生顯色反應(yīng),則會(huì)紅移至415nm 處,這與其他文獻(xiàn)中510nm[19,20]波長(zhǎng)不符,推測(cè)顯色終點(diǎn)可能與溫度有一定關(guān)系。

    考慮到高原地區(qū)光照時(shí)間長(zhǎng),蕁麻植株受光照面積相較于低海拔地區(qū)更為充足,這也許是其黃酮含量相較于低海拔地區(qū)蕁麻中黃酮含量高的因素之一。

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