血清同型半胱氨酸水平與單核細(xì)胞亞型及頸動脈動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性

吳 燕 姜烜星 王雪梅 王 麗

1.河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院健康管理中心，甘肅張掖 734000；2.河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，甘肅張掖 734000

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）是動脈粥樣硬化及血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)因素[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，約40%的心腦血管疾病患者合并HHcy，而健康群體中僅有15%合并HHcy[3]。研究顯示同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）可能參與動脈粥樣硬化斑塊生成及脫落為血栓的過程，但其致斑塊穩(wěn)定性變化的機(jī)制目前尚不明確[4]。Hcy 可誘導(dǎo)單核細(xì)胞向炎癥型分化，并產(chǎn)生促炎作用，而炎癥型單核細(xì)胞是動脈粥樣硬化進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞[1]。因此，HHcy可能與單核細(xì)胞亞群的比例有相關(guān)性，且參與調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化患者的斑塊穩(wěn)定性。本研究擬探討血清Hcy 水平與單核細(xì)胞等動脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素之間的相關(guān)性，并分析Hcy 與單核細(xì)胞亞型、斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2020 年11 月至2022 年2 月于河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院健康管理中心體檢的246 例體檢者進(jìn)行回顧性隊(duì)列研究，納入對象年齡40～70 歲，根據(jù)超聲檢查有無頸動脈斑塊及斑塊性質(zhì)，將其分為健康對照組（無頸動脈斑塊，40 例）、穩(wěn)定斑塊組（101例）和不穩(wěn)定斑塊組（105 例）。頸動脈斑塊的診斷參照《中國腦卒中血管超聲檢查指導(dǎo)規(guī)范》[5]：內(nèi)-中膜厚度（intimal medial thickness，IMT）≥1.5mm，凸出于血管腔內(nèi)，或局限性內(nèi)膜增厚高于周邊IMT的50%時(shí)，定義為動脈粥樣硬化斑塊形成。其中扁平斑、硬斑為穩(wěn)定斑塊，軟斑、潰瘍斑為不穩(wěn)定斑塊，同時(shí)存在穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊者歸為不穩(wěn)定斑塊。排除既往有明確冠心病、糖尿病病史者；曾行冠狀動脈支架植入術(shù)或旁路移植術(shù)者；合并各種急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、造血功能障礙、H 型高血壓、肝腎功能障礙者；使用降血脂藥物、糖皮質(zhì)激素等其他影響免疫系統(tǒng)或造血功能的藥物者。

1.2 觀察指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)包括血脂指標(biāo)、Hcy、單核細(xì)胞比例。為進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，將以下變量定義為分類變量：Hcy≥15.0μmol/L 為高Hcy，Hcy＜15μmol/L 為正常Hcy，單核細(xì)胞比例＞8%為單核細(xì)胞升高，3%～8%為正常水平。血常規(guī)檢查由希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司生產(chǎn)的XN9000 全自動血細(xì)胞分析儀測定。生化項(xiàng)目由西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司生產(chǎn)的ADV IA2400 全自動生化分析儀測定。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取和儲存

患者超聲檢查當(dāng)天，收集血液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。全血3000 轉(zhuǎn)/min 離心15min 去除血漿，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）1 ∶1 稀釋，并在Ficoll-Paque 上、25℃下2000 轉(zhuǎn)/min 離心20min。從中間相中提取PBMC，PBS 洗滌3 次，每次10min。將PBMC 手動重懸于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中并儲存于–80℃。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析

另招募30 例頸動脈斑塊患者（穩(wěn)定斑塊15 例、不穩(wěn)定斑塊15 例）采用流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞分型，并分析其與血清Hcy 水平的關(guān)系。根據(jù)國際免疫學(xué)會對單核細(xì)胞的分類，基于單核細(xì)胞表面CD14和 CD16 的表達(dá)強(qiáng)度，將單核細(xì)胞分為炎癥型（CD14++CD16-）和定居型（CD14+CD16+）。流式分析數(shù)據(jù)采用Flowjo 10.4 軟件進(jìn)行處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖像繪制。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析，不服從正態(tài)分布的則以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。采用Spearman 和Pearson 相關(guān)性分析法分析Hcy 與血脂指標(biāo)的相關(guān)性；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組研究對象的臨床特征比較

三組研究對象的年齡、性別、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、載脂蛋白B 比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；吸煙＞5 年、Hcy≥15μmol/L比例、Hcy、單核細(xì)胞比例、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、載脂蛋白A 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組研究對象的臨床特征比較

2.2 血清Hcy 與血脂及單核細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清Hcy 水平與單核細(xì)胞比例、TC、TG、LDL、載脂蛋白A、載脂蛋白B水平均呈較弱的正相關(guān)（P＜0.05），而與HDL 水平呈弱的負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 血清Hcy 水平與血脂及單核細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

2.3 單核細(xì)胞亞型對頸動脈斑塊性質(zhì)的影響

不穩(wěn)定斑塊組的單核細(xì)胞總數(shù)量、炎癥型單核細(xì)胞數(shù)量、血清Hcy 水平均顯著高于穩(wěn)定斑塊組（P＜0.05），見表3。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，炎癥型單核細(xì)胞與血清Hcy 水平呈弱的正相關(guān)（r2=0.664，P＜0.001），見圖1。

表3 不同頸動脈斑塊性質(zhì)的單核細(xì)胞亞型數(shù)量及Hcy 水平比較（）

表3 不同頸動脈斑塊性質(zhì)的單核細(xì)胞亞型數(shù)量及Hcy 水平比較（）

圖1 炎癥型單核細(xì)胞與Hcy 水平的相關(guān)性

3 討論

頸動脈粥樣硬化斑塊是腦血管血栓栓塞的主要來源，不穩(wěn)定斑塊的形成與炎癥密切相關(guān)。不穩(wěn)定斑塊的形成可增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。腦梗死致殘率高，嚴(yán)重危害人類健康，并增加社會和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，HHcy 增加血管炎性反應(yīng)及斑塊面積，血清Hcy 水平每升高5μmol/L，則心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加1.6～1.8 倍[7]。本研究顯示，不穩(wěn)定斑塊組患者的血清Hcy 水平高于穩(wěn)定斑塊組和健康對照組，穩(wěn)定斑塊組患者的血清Hcy 水平高于健康對照組，這與石程程等[6]研究結(jié)果一致。

近年來，大量研究證實(shí)動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥過程[8-12]。為此，筆者分析了不同組間Hcy 水平與血脂指標(biāo)之間的關(guān)系，進(jìn)一步為Hcy 水平升高與斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)提供解釋。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清Hcy 水平與TC、TG、LDL、載脂蛋白A、載脂蛋白B 水平具有較弱的正相關(guān)，與HDL 水平具有弱的負(fù)相關(guān)。這一現(xiàn)象可通過Ravnskov 等[13]的假說來解釋。該假說認(rèn)為，不穩(wěn)定斑塊起源于與微生物復(fù)合的脂蛋白聚集體造成的血管阻塞，而這一過程因Hcy 硫代內(nèi)酯聚集脂蛋白而加劇發(fā)展。HHcy 導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙、血管阻塞，造成動脈壁缺血、壁內(nèi)細(xì)胞死亡、毛細(xì)血管破裂，繼而動脈內(nèi)膜內(nèi)微生物釋放，引起出血、炎癥，最終導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊形成。

單核細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞，是動脈粥樣硬化形成過程中最常見的炎癥細(xì)胞，是斑塊重要組成部分，同時(shí)也是易損斑塊形成的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。在動脈粥樣硬化斑塊形成的過程中，外周血單核細(xì)胞遷移至動脈內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞，攝取氧化的LDL，從而構(gòu)成動脈粥樣硬化病變的核心并導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊的形成[14]。近年來，研究顯示炎癥型單核細(xì)胞在動脈硬化粥樣斑塊形成與破裂過程中至關(guān)重要；相反，定居型單核細(xì)胞在病變早期可通過抑制局部炎癥及延緩斑塊進(jìn)展、在斑塊破裂后通過抑制血栓形成及促進(jìn)新生血管生成等途徑改善局部心肌灌注。有研究認(rèn)為白細(xì)胞及其亞型數(shù)目與梗死灶周圍炎性反應(yīng)、強(qiáng)度和斑塊穩(wěn)定性相關(guān)[6,15-17]。然而，有關(guān)斑塊穩(wěn)定性和單核細(xì)胞分型及亞型的比例之間是否具有一定關(guān)系卻很少被人研究，現(xiàn)有研究主要集中在單核細(xì)胞與早期疾病階段之間的關(guān)聯(lián)，例如頸動脈內(nèi)膜中層厚度[18]。本研究通過回顧性分析246例體檢者的病歷資料，研究血清Hcy 水平與頸動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及其獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素之間的關(guān)系；通過募集的30 例頸動脈斑塊患者的血液樣本，分析單核細(xì)胞亞型、斑塊穩(wěn)定性、血清Hcy 水平之間的聯(lián)系。相比于穩(wěn)定型斑塊患者，不穩(wěn)定斑塊患者的總CD14+單核細(xì)胞和炎癥型單核細(xì)胞增加，而定居型單核細(xì)胞未見明顯變化；提示Hcy 可能促進(jìn)循環(huán)單核細(xì)胞向炎癥型分化，進(jìn)而通過局部產(chǎn)生炎癥因子和蛋白酶來促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊的形成。本研究以觀察性研究為主，暫尚無直接證據(jù)來確定因果關(guān)系，還需今后通過動物模型及大樣本量研究進(jìn)一步驗(yàn)證。