竹子快速生長過程中糖分代謝與運輸機制研究

劉 毅 鄧 琳 李鵬程 裴佳龍 唐國建 趙景威 王曙光,3*

(1 云南省高校叢生竹生物學重點實驗室 西南林業(yè)大學生命科學學院 昆明 650224；2 國家林草局科技創(chuàng)新團隊 西南林業(yè)大學生命科學學院 昆明 650224；3 竹藤科學研究院 西南林業(yè)大學林學院 昆明 650224)

竹子是世界上生長最快的植物，竹稈可以在一個生長季節(jié)內(nèi)完成高生長，沒有其他植物具有可比的生物量產(chǎn)量。有關(guān)竹子快速生長的機制是一個熱門的研究課題。目前大多數(shù)的研究都集中在竹子快速生長分子調(diào)控機制上，篩選相關(guān)的基因，但忽略了竹子在快速生長過程中關(guān)鍵的解剖與生理學特征。

在植物的營養(yǎng)組織中，可溶性糖和淀粉是碳水化合物儲存的2種主要形式。竹子與其他自養(yǎng)植物一樣，蔗糖、葡萄糖和果糖是可溶性碳水化合物的主要構(gòu)成組分，與淀粉一起構(gòu)成參與生理代謝和滲透調(diào)節(jié)等過程的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物。在竹筍快速生長過程中，由于竹筍生長迅速，內(nèi)源可溶性糖和淀粉的消耗是巨大的。竹子幾乎將其葉、枝、稈和地下竹鞭的所有非結(jié)構(gòu)碳水化合物運輸?shù)街窆S上。盡管一些研究人員已經(jīng)將重點放在竹筍快速生長過程中碳水化合物的變化上，但很少有關(guān)于蔗糖和淀粉代謝的研究。蔗糖作為葉片光合作用的主要終產(chǎn)物之一，在植物生長發(fā)育中起著核心作用。蔗糖在葉片細胞質(zhì)中合成，并裝載到韌皮部運輸?shù)綆旖M織。韌皮部卸載有共質(zhì)體卸載和質(zhì)外體卸載2種途徑。但在同化物轉(zhuǎn)運中，共質(zhì)體運輸途徑占主導地位，因為它具有較高的轉(zhuǎn)運能力，且對同化物轉(zhuǎn)運的阻力較小。

為了進一步深入研究竹子快速生長過程中的糖分代謝與轉(zhuǎn)運機制，課題組系統(tǒng)研究了云南箭竹快速伸長過程中的糖分代謝變化，分析了幼竹快速伸長過程中節(jié)間韌皮部卸載和卸載后運輸?shù)臋C制，以及光合同化物在縱向和橫向不同時間的運輸速率，并探討了韌皮部卸載和韌皮部后運輸?shù)挠绊懸蛩?，以期更好地理解糖分代謝與運輸及水分運輸在竹子的快速生長過程中所扮演的重要角色。相關(guān)研究成果分別發(fā)表在《Tree Physiology》[1]、《Physiologia Plantarum》[2]和《Frontiers in Plant Science》[3]，本文綜合介紹了3篇文章的研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料處理

云南箭竹為合軸散生型竹種，平均高度約為10 m，通常9月份發(fā)筍。實驗選擇云南箭竹未伸長、快速伸長和成熟階段的節(jié)間作為材料。

根據(jù)云南箭竹竹子節(jié)間的伸長程度，獲得不同發(fā)育階段的樣品。為了測定內(nèi)源可溶性糖、淀粉以及蔗糖和淀粉代謝酶的活性，每個稈的樣品首先分為外部區(qū)域(靠近竹青)和內(nèi)部區(qū)域(靠近竹黃)，然后分為上部(靠近籜環(huán))、中部和下部(靠近稈環(huán))，液氮冷凍保存。其他樣品FAA固定劑(1.85%甲醛、45%乙醇和0.25%乙酸)固定。

1.2 內(nèi)源可溶性糖和淀粉含量測定

每個樣品取2 g幼竹節(jié)間組織在液氮中充分研磨，然后在70 ℃下用10 mL去離子水提取，收集上清液以測定可溶性糖含量。用5 mL去離子水第2次提取后，將沉淀物儲存在-20 ℃中測定淀粉含量。將上清液冷凍干燥，再溶于1 mL去離子水中，保存在-20 ℃，用高效液相色譜法測定葡萄糖、果糖和蔗糖含量。采用苯酚-硫酸法測定不同發(fā)育階段節(jié)間的淀粉含量，離心提取的沉淀物干燥、稱重并用去離子水煮沸，取上清液用于測定淀粉含量。

1.3 淀粉粒、蔗糖和葡萄糖的組織定位

采用高碘酸-希夫(PAS)反應(yīng)法對節(jié)間發(fā)育過程中的淀粉粒進行定位。采用Martinelli(2008)和Polit(2012)的方法進行葡萄糖和蔗糖原位染色。

1.4 蔗糖和淀粉代謝酶活性測定

為了測定蔗糖代謝酶活性，將處于不同發(fā)育階段的節(jié)間樣品在液氮中研磨，并在12 000 r.p.m.、4 ℃下離心30 min。用1 mL的提取緩沖液，包括50 mM KPO4(pH值為7.5)，1 mM EDTA和5 mM MgCl2組成的提取緩沖液。將上清液收集在透析管中，并對1 L的10 mM KPO4(pH值為7.5) 在4 ℃下透析。

為測定淀粉代謝酶活性，將處于不同發(fā)育階段的節(jié)間樣品(1 g)在液氮中研磨，用1 mL提取緩沖液在12 000 r.p.m、4 ℃下離心30 min。其中包含100 mM HEPES緩沖液(pH值為7.4)，10%(v/v)甘油，2 mM EDTA，2 mM EDTA，3 mM EDTA(v/v)甘油，EDTA 2 mM，0.1%牛血清白蛋白(BSA)，DTT 5 mM，MgCl25 mM和2%(w/v)PVP。上清液保存在4 ℃以備活性測量。

隨著我國基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)的飛速發(fā)展，其為我國水利工程的施工建設(shè)與發(fā)展作出較大貢獻。高壓管道下平段固結(jié)灌漿施工工藝作為水利工程施工中的必須使用的工藝對水利工程的施工質(zhì)量與水平具有重要影響。

1.5 韌皮部卸載和韌皮部后運輸途徑觀測

為了明確韌皮部卸載和韌皮部后運輸途徑，對幼竹第8節(jié)間的籜葉施加200 μL CFDA的溶液。實驗分別在09∶00、12∶00、18∶00和00∶00進行。每次使用3株幼筍進行重復。熒光顯微鏡(尼康E400)熒光觀察，并計算了CF在幼稈中向上和向下方向的縱向運輸速率。

1.6 伸長節(jié)間中的水分運輸觀測

采用酸性品紅示蹤伸長竹節(jié)間的水分運輸。分別在09∶00、12∶00、18∶00和00∶00時通過在伸長節(jié)間中注入酸性品紅溶液(4 g/L)持續(xù)測定第8節(jié)間的水分傳輸速率。所有樣本立即放入-20 ℃冰箱里帶回實驗室徒手切片，光鏡觀察。采用PSY1 Stem Psychrometer系統(tǒng)和液體壓力傳感器，測定伸長節(jié)間的原位水勢和原位水壓。實驗以6株幼竹為實驗對象，連續(xù)測量3 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹子生長過程中的糖分代謝

在竹子節(jié)間快速伸長生長期間，淀粉含量持續(xù)下降，未伸長的節(jié)間淀粉含量最高，成熟節(jié)間淀粉含量最低。這意味著竹子在節(jié)間伸長過程中消耗了大量的淀粉。此外，在幼竹節(jié)間伸長過程中，竹青處的淀粉含量始終高于竹黃處的淀粉含量?？扇苄蕴呛侩S著節(jié)間快速伸長而顯著增加，然后顯著減少，快速伸長階段的內(nèi)源可溶性總糖含量最高。

蔗糖含量和內(nèi)源可溶性總糖含量的變化趨勢相似。蔗糖含量在迅速伸長的節(jié)間最高，然后隨著節(jié)間的停止生長而急劇下降。在未伸長和快速伸長階段，竹青的蔗糖含量顯著高于竹黃，在成熟階段略高于竹黃。在可溶性糖中，葡萄糖在節(jié)間伸長過程中含量最高，表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。在橫切面上，外部區(qū)域的葡萄糖含量也高于內(nèi)部區(qū)域。果糖和麥芽糖在所有發(fā)育階段的節(jié)間也表現(xiàn)出相同的變化趨勢。這些結(jié)果表明，在快速伸長的節(jié)間發(fā)生強烈的淀粉和可溶性糖的分解代謝，節(jié)間伸長消耗了大量的淀粉和可溶性糖。

在竹子快速伸長過程中，節(jié)間糖分含量的動態(tài)變化通常與節(jié)間伸長過程中的相關(guān)酶活性變化有關(guān)。蔗糖代謝關(guān)鍵酶，如酸性轉(zhuǎn)化酶SAI、細胞壁轉(zhuǎn)化酶CWI和蔗糖合成酶SUSY的活性與節(jié)間伸長表現(xiàn)出明顯一致變化的趨勢。SAI、CWI和SUSY在快速伸長的節(jié)間表現(xiàn)出最高的活性，隨著節(jié)間伸長的完成，活性也顯著降低。在節(jié)間伸長過程中，竹壁外側(cè)的活性也顯著高于竹壁內(nèi)側(cè)，這也與可溶性糖在橫切面上的分布一致。此外，在節(jié)間伸長過程中，SAI和SUSY的活性遠遠高于CWI，表明在竹子節(jié)間快速伸長過程中SAI和SUSY對蔗糖降解發(fā)揮了更重要的作用。

AGPase與淀粉的合成有關(guān)，淀粉磷酸化酶(STP)和α-和β-淀粉酶參與淀粉降解。AGPase活性隨節(jié)間伸長而持續(xù)下降，而STP和α-和β-淀粉酶則在快速伸長的節(jié)間表現(xiàn)出最高的活性，這表明隨著節(jié)間的快速伸長，淀粉降解顯著。由于α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性遠低于STP，因此，STP在節(jié)間伸長過程中對淀粉降解起著關(guān)鍵作用。

通過對淀粉粒、蔗糖和葡萄糖的組織定位發(fā)現(xiàn)，在竹子快速伸長的節(jié)間維管束內(nèi)和維管束周圍的薄壁細胞中分布著大量淀粉粒、蔗糖和葡萄糖，形成了碳水同化物的運輸/儲存的分布網(wǎng)絡(luò)。竹青處維管束內(nèi)與維管束間薄壁細胞比竹黃處維管束中的薄壁細胞碳水同化物的含量更高。在快速伸長節(jié)間靠近竹黃處的維管束中，碳水同化物沿4個方向分布，即后生導管和原生導管之間的2條薄壁組織線路，以及后生導管與韌皮部之間的2條薄壁組織線路。在竹青處，由于原生導管和后生導管纖維鞘的閉合，碳水同化物只分布在韌皮部與后生導管之間的2條線路。這意味著糖分在竹壁內(nèi)部區(qū)域的維管束中沿4個方向進行卸載運輸和貯存，在外側(cè)區(qū)域沿著2個方向向外進行卸載運輸與貯存，它們共同構(gòu)成了竹子節(jié)間碳水同化物的網(wǎng)絡(luò)分布。

此外，通過對蔗糖與淀粉代謝的關(guān)鍵酶活性進行組織定位，也表現(xiàn)出相同的變化趨勢，說明維管束內(nèi)及維管束間的薄壁細胞是竹子節(jié)間組織糖分代謝的主要場所，且竹壁外側(cè)高于內(nèi)側(cè)。

2.2 糖分卸載機制及運輸途徑分析

在籜葉上施用CFDA后，在陽光下，靠近縱切面節(jié)點的內(nèi)部區(qū)域的維管束中觀察到明顯的淺黃色。這表明CF被徑向運輸?shù)絻?nèi)部區(qū)域的維管束中，說明籜片中的糖分可以直接被運輸至幼筍或者幼竹快速伸長節(jié)間內(nèi)側(cè)的維管束中。在橫切面上，可以看到CF的熒光主要分布維管束內(nèi)及維管束間的薄壁組織中。透射電子顯微鏡觀察，伴胞與周邊的薄壁細胞以及薄壁細胞與薄壁細胞之間通過胞間連絲連接。這些觀察揭示了竹子節(jié)間韌皮部與維管束內(nèi)和維管束周圍的薄壁細胞，共同構(gòu)成了一個共質(zhì)體卸載與運輸路徑。

通過記錄幼筍中CF的運輸速率，發(fā)現(xiàn)CF染料在伸長的幼竹節(jié)間，能夠同時向上和向下輸送。白天，CF向下運輸速率高于向上運輸速率。夜間，向上運輸率卻顯著高于向下運輸速率。此外，在中午12∶00，CF向上和向下方向的運輸速率均低于夜間的運輸速率。這些研究結(jié)果表明：快速生長幼竹中的同化物，在白天以向下運輸為主，而在夜間主要以向上運輸為主。中午強烈的蒸騰作用抑制幼竹中的同化物運輸。

此外，在竹壁橫切面上，CF由內(nèi)側(cè)竹壁向外側(cè)的運輸速率遠遠高于由竹壁外側(cè)向內(nèi)側(cè)的運輸速率。CF的橫向運輸速率也隨時間變化而變化，在中午12∶00最低，在夜間00∶00最高。因此，竹壁內(nèi)側(cè)維管束間的薄壁細胞與竹壁外側(cè)的維管束間薄壁細胞在橫切面上構(gòu)成了一個由內(nèi)向外的徑向運輸網(wǎng)絡(luò)，作為韌皮部卸載后的碳水同化物的徑向運輸和貯存的場所。竹壁維管束間的薄壁細胞扮演著“維管射線”的角色，行使橫向運輸功能。節(jié)間纖維和薄壁細胞壁的木質(zhì)化與栓質(zhì)化阻礙了質(zhì)體外的運輸。

當CFDA施加于母竹的樣本時，在竹筍所有發(fā)育階段，包括未伸長、快速伸長和成熟階段的幼竹中均觀察到羧基熒光素的分布，但CF由母竹向竹筍的運輸速率也與竹筍自身的發(fā)育程度相關(guān)。在未伸長竹筍中的運輸速率最小，快速伸長中竹筍的運輸速率最大，成熟幼竹的運輸速率次之。此外，從母竹到幼筍的CF運輸速率也表現(xiàn)出在夜間00∶00高于中午12∶00的變化趨勢。因此，糖分由母竹運輸至竹筍的速率既與竹筍自身的發(fā)育程度相關(guān)，也與晝夜的時間變化相關(guān)。

2.3 竹子快速伸長節(jié)間中的水分運輸與糖分運輸?shù)南嚓P(guān)性分析

與CF不同的是，酸性品紅在快速伸長的枝條中只是向上運輸。因此，只記錄向上的運輸速率。酸性品紅注入后，酸性品紅呈放射狀經(jīng)維管束內(nèi)和維管束間的薄壁細胞在竹壁內(nèi)進行橫向運輸。此外，竹壁內(nèi)的薄壁細胞的染色比大多數(shù)纖維細胞深，韌皮部和靠近維管束的纖維細胞被染成淡紅色，顯示少量酸性品紅隨著水的流動擴散到這些細胞中。因此，竹子節(jié)間維管束內(nèi)及維管束間的薄壁細胞不僅構(gòu)成了竹壁內(nèi)同化物徑向運輸?shù)闹饕窂?，也是水分徑向運輸?shù)闹饕窂健?/p>

通過比較CF運輸與水分運輸速率，可以發(fā)現(xiàn)韌皮部中的CF運輸速率的變化動態(tài)與木質(zhì)部中水分運輸?shù)淖兓瘎討B(tài)在傍晚19∶00至次日09∶00 一致。但在中午12∶00，水分運輸速率很高，CF運輸速率卻很低。為了分析韌皮部糖分運輸和水分運輸之間的關(guān)系，對不同時間伸長節(jié)間的CF運輸速率和水分運輸速率以及水勢和水壓進行了相關(guān)分析。結(jié)果顯示，韌皮部向上的CF運輸速率，在19∶00次日09∶00與水分運輸速率和水壓呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，但在中午12∶00 與水分運輸速率呈顯著負相關(guān)。在19∶00次日09∶00，CF在橫切面向外的運輸速率與水壓和水分運輸速率也呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。CF向下輸送也表現(xiàn)出同樣的趨勢。中午，快速伸長的竹筍表現(xiàn)出更高的水分運輸速率，但具更低的水壓值和CF運輸速率，這主要是由于中午更高的蒸騰速率造成的。因此，認為夜間的水分運輸可以促進韌皮部的糖分運輸，但在中午抑制韌皮部中的糖分運輸。

2.4 籜鞘是竹筍快速生長過程中的糖分與水分運輸控制器

竹節(jié)間伸長主要依賴于水分和總可溶性糖濃度的增加。當稈籜被縱向切除時，快速生長的竹筍節(jié)間會在一夜間向節(jié)間裸露側(cè)彎曲。竹稈節(jié)間大部分水分會在稈籜的切割處流失，這便抑制了彎曲側(cè)的水壓、水分和同化物運輸速率的增加，甚至阻礙了淀粉和可溶性糖的水解，降低了SAI、CWI、SUSY和節(jié)間裸露側(cè)的STP。而在背彎側(cè)的節(jié)間外側(cè)，較高含量的可溶性糖進一步促進了水分的流入和液泡的膨脹。在背彎側(cè)的薄壁細胞中，觀察到了較薄的細胞質(zhì)層，這也表明這些細胞中的水壓較高。在裸露側(cè)(彎曲側(cè))中水分和同化物的運輸速率也有所降低。

與背彎側(cè)相比，較高的水分流入、糖分運輸和分解代謝提高了背彎側(cè)的膨脹壓力，促進了背彎側(cè)細胞的擴張，而彎曲側(cè)有水分的喪失、水壓的下降，以及糖分代謝的抑制，限制了細胞的伸長生長，然后節(jié)間變得彎曲。在夜間，無論是彎曲的節(jié)間還是正常伸長的節(jié)間，葡萄糖在總可溶性糖中所占的比例都是最大的。因此，葡萄糖代謝在細胞擴張和節(jié)間彎曲生長中不起關(guān)鍵作用。竹子節(jié)間彎曲生長的主要原因是節(jié)間內(nèi)外伸長區(qū)的水分壓力和糖分水解(包括淀粉和蔗糖)水平的差異導致了細胞擴張的顯著差異。筍鞘在竹筍快速生長過程中起著重要的調(diào)控作用，它通過調(diào)節(jié)節(jié)間水分運輸和壓力以及糖分的運輸和代謝來實現(xiàn)竹筍的快速生長。

3 結(jié)論

云南箭竹的筍芽一般在5月中旬形成，在土壤中的發(fā)育期長達4～5個月，通常到雨季中期9月左右才能破土而出。竹筍一旦萌發(fā)出土，就能快速生長，在一個季度內(nèi)完成高生長。傳統(tǒng)的觀點認為，竹筍在地下生長階段是地上部分快速生長的養(yǎng)分積累階段。根據(jù)我們的實驗結(jié)果同樣顯示，筍芽中的淀粉含量顯著高于其他可溶性糖的含量，竹子在節(jié)間伸長過程中消耗了竹筍中的淀粉。此外，在節(jié)間快速伸長過程中，由母竹運輸至竹筍的碳水同化物的運輸速率也顯著提升。隨著節(jié)間伸長，淀粉含量和AGPase活性不斷下降，STP在淀粉降解過程中扮演主要角色?？扇苄蕴?，包括蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖等，在快速伸長的節(jié)間中含量最高，然后隨著節(jié)間伸長生長的完成顯著下降。

在竹子快速伸長節(jié)間的內(nèi)部區(qū)域，碳水同化物沿維管束薄壁細胞向4個方向卸載和徑向運輸，但在外部區(qū)域的維管束中僅沿2個方向運輸。在橫切面上，同化物從竹子節(jié)間的內(nèi)部區(qū)域向外部區(qū)域徑向運輸。維管束內(nèi)外的薄壁細胞是糖分代謝的主要場所，這些薄壁細胞構(gòu)成了糖分的共質(zhì)體徑向運輸網(wǎng)絡(luò)。竹子節(jié)間維管束間的薄壁細胞扮演著“射線”細胞的角色。SAI、CWI和STP的活性隨節(jié)間伸長顯著增加，促進了糖分的卸載和卸載后運輸。竹子節(jié)間卸載后的徑向運輸和縱向運輸均和水分運輸相關(guān)。在快速伸長時，竹子節(jié)間維管束內(nèi)及維管束間的薄壁細胞也是水分徑向運輸?shù)闹饕窂?。從晚?9∶00到次日09∶00，木質(zhì)部CF運輸速率與水分運輸速率基本一致，但中午12∶00水分運輸速率很高，CF運輸速率很低。說明在夜間，水分運輸促進了同化物的轉(zhuǎn)運，但在中午卻抑制了同化物的轉(zhuǎn)運。

竹子節(jié)間的伸長生長主要依賴于水分的組織壓力與總可溶性糖的濃度。一旦籜鞘被切除，大部分水分會從切口處泄露，就會限制了水壓的提高與糖分及水分的運輸速率，甚至是降低了糖分與淀粉的水解，并降低了相關(guān)的酶活性。相對于裸露的稈壁，籜鞘包裹的稈壁的高濃度的可溶性糖促進水分的流入及液泡的膨脹與細胞的伸長生長，進而引起稈壁的彎曲生長。在竹筍的快速生長過程中，籜鞘起到控制器的功能，在調(diào)節(jié)水分運輸與壓力、糖分運輸與代謝方面扮演重要角色。