功能矯形對(duì)安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合模型大鼠髁突軟骨生長(zhǎng)發(fā)育及VEGF表達(dá)的影響

[摘要]目的：探討安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合模型大鼠在接受功能矯形后其髁突軟骨生長(zhǎng)發(fā)育及VEGF表達(dá)的情況。方法：安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合模型大鼠30只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=15，佩戴咬合前導(dǎo)矯治器，連續(xù)佩戴30 d），對(duì)照組（n=15，不佩戴咬合前導(dǎo)矯治器）。處死大鼠，觀察兩組大鼠雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨前、中、后部生長(zhǎng)發(fā)育情況、軟組織形態(tài)、VEGF陽(yáng)性表達(dá)、VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)果：建模前兩組髁突軟骨厚度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），建模后實(shí)驗(yàn)組各部厚度明顯較對(duì)照組更厚，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組軟骨增殖層細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組有所上升，細(xì)胞核有明顯變大，成熟層細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)增長(zhǎng)，肥大層細(xì)胞數(shù)量、分泌量與對(duì)照組相比呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，軟骨中部、后部纖維層變化不明顯。VEGF在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中表達(dá)為棕黃色，兩組后部陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于中部，中部陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于前部，其中，對(duì)照組髁突軟骨前部、中部、后部VEGF蛋白陽(yáng)性數(shù)均低于實(shí)驗(yàn)組。兩組髁突軟骨VEGF蛋白表達(dá)在前、中、后部呈階梯狀增長(zhǎng)，各部對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。結(jié)論：功能矯形可促進(jìn)安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合大鼠下頜髁突軟骨局部生長(zhǎng)，提高VEGF表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合;功能矯形;髁突軟骨;SD大鼠

[中圖分類號(hào)]R783.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2022）03-0103-04

Effects of Functional Orthopedics on the Growth and Development of Condylar Cartilage and the Expression of VEGF in Angel's Class Ⅱ Malocclusion Model Rats

ZHENG Xinyu

（Department of Stomatology，Heze Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong Province，Heze 274000，Shandong，China）

Abstract： Objective To investigate the growth and development of condylar cartilage and the expression of VEGF in Angel's Class Ⅱ malocclusion model rats after functional orthopedics. Methods Thirty Angle Class Ⅱ malocclusion model rats were randomly divided into experimental group （with occlusal guide appliance for 30 days） and control group （without occlusal guide appliance）. The rats were sacrificed， and the growth and development of the anterior， middle and posterior parts of the bilateral temporomandibular joint condylar cartilage， soft tissue morphology， VEGF positive expression and VEGF protein expression were observed in the two groups of rats. Results? Before modeling，there was no significant difference in the thickness of condylar cartilage between the two groups （P>0.05）. After modeling， the thickness of each part in the experimental group was significantly thicker than that in the control group （all P<0.05）. Compared with the control group， the number of cells in the proliferative layer of the cartilage in the experimental group increased， the nuclei became larger， the mature layer cells and intercellular substance increased， and the number and secretion of the hypertrophic layer cells increased compared with the control group. The fibrous layer did not change significantly. The expression of VEGF in cytoplasm and cell membrane was brownish yellow. The number of positive cells in the rear of the two groups was higher than that in the middle， and the number of positive cells in the middle was higher than that in the front. Among them， the positive number of VEGF protein in the front， middle and rear of condylar cartilage in the control group was lower than that in the experimental group. The expression of VEGF protein in the anterior， middle and posterior parts of the condylar cartilage in the two groups increased in a step-like manner， and the differences in each part were statistically significant （all P<0.05）. Conclusion Functional orthopedics can promote the local growth of mandibular condyle cartilage and increase the expression of VEGF in Angle Class Ⅱ malocclusion rats.

Key words： vascular endothelial growth factor; Angle Class Ⅱ malformation; functional orthopedics; articular cartilage; SD rats

安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合畸形是我國(guó)常見(jiàn)的一種錯(cuò)牙合畸形，嚴(yán)重的錯(cuò)牙合畸形表現(xiàn)為牙齒排列異常，或者骨骼異常改變[1]。功能性矯治器能幫助下頜前伸，促進(jìn)髁突軟骨的成長(zhǎng)和重建，使下頜位置后縮得以糾正，下頜發(fā)育不足得到改善，在矯正兒童生長(zhǎng)發(fā)育期間牙齒畸形效果較好[2]。近年來(lái)，大量臨床研究發(fā)現(xiàn)固定類功能矯治器也適用于成人，治療效果也很好，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為下頜骨功能整形擴(kuò)張可以促進(jìn)髁突軟骨的成長(zhǎng)和代謝，延長(zhǎng)下頜骨的長(zhǎng)度，達(dá)到Ⅱ類錯(cuò)牙合矯正的目的[3-4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）作為重要的血管新生因子，可通過(guò)旁分泌產(chǎn)生作用，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，促進(jìn)血管新生，形成調(diào)節(jié)骨[5]。此外，VEGF涉及胚胎發(fā)生中的血管新生的過(guò)程以及炎癥及創(chuàng)傷的治愈過(guò)程，近年來(lái)，在長(zhǎng)骨中也有VEGF的發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞中也有VEGF表達(dá)，長(zhǎng)骨VEGF在軟骨內(nèi)骨形成中發(fā)揮重要作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)中的大鼠髁突和顳骨中檢測(cè)出VEGF表達(dá)，下頜骨髁突中的軟骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了VEGF，可刺激血管形成[7]。由此本文通過(guò)建立安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合模型大鼠，探討功能矯形對(duì)安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合模型大鼠髁突軟骨生長(zhǎng)發(fā)育及VEGF的表達(dá)的作用。

1? 材料和方法

1.1 模型建立：自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，購(gòu)買9周齡的SD大鼠30只，體重為（239.91±21.86）g。30只大鼠采用速眠新Ⅱ麻醉（腹腔注射0.3～0.8 ml/kg），利用粘接材料將斜面導(dǎo)板粘固于上切牙，調(diào)整下頜切牙與斜面導(dǎo)板的接觸面，斜面導(dǎo)板與上頜平面呈約25°角，以保證下頜不發(fā)生偏斜。通過(guò)固位鉤將鏈狀橡皮圈經(jīng)鼻上頜復(fù)合體與防護(hù)頸圈連接，使得斜面導(dǎo)板獲得穩(wěn)定的固位，防護(hù)頸圈能夠有效地防止大鼠前爪對(duì)裝置的破壞及對(duì)面部組織的傷害。見(jiàn)圖1。

1.2 分組：將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（佩戴咬合前導(dǎo)矯治器）15只，持續(xù)佩戴30 d;對(duì)照組（不佩戴咬合前導(dǎo)矯治器）15只，建模結(jié)束所有動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。

1.3 觀察兩組髁突軟骨前、中、后部的4個(gè)指標(biāo)：①生長(zhǎng)發(fā)育情況;②組織形態(tài);③VEGF陽(yáng)性表達(dá)情況;④VEGF蛋白表達(dá)情況。

1.3.1 光鏡觀察軟骨生長(zhǎng)發(fā)育情況：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組動(dòng)物飼養(yǎng)30 d后進(jìn)行深度麻醉處死，暴露大鼠顴弓，取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)，對(duì)關(guān)節(jié)盤前帶最厚處、中帶最厚處、后帶最厚處進(jìn)行厚度測(cè)量，采用Olympus CX31型光學(xué)顯微鏡，在40倍鏡下觀察，并使用Pixera PVC100C系統(tǒng)采集圖片，電子測(cè)量尺測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的髁突軟骨厚度進(jìn)行記錄。

1.3.2 HE染色觀察軟骨組織形態(tài)：將取出的雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)進(jìn)行甲醛溶液固定，乙醇溶液進(jìn)行脫水，石蠟包埋后取出髁突縱向切片5 μm，用山羊血清進(jìn)行封閉處理，蘇木精和伊紅染色液復(fù)染分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察雙側(cè)顳下頜組織形態(tài)。

1.3.3 免疫組化染色觀察VEGF陽(yáng)性表達(dá)情況：將取出的雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)進(jìn)行甲醛溶液固定，石蠟包埋后取出髁突縱向切片5 μm，乙醇溶液實(shí)施脫水，滴加抗原消化液、修復(fù)液，山羊血清實(shí)施封閉，按1∶50比例加入一抗及二抗，用DAB實(shí)施染色，蒸餾水終染，再蘇木素襯染，脫水后可封片，于顯微鏡下觀察到髁突軟骨VEGF表達(dá)為棕（褐）色即為陽(yáng)性。VEGF陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)方法：組織切片收集后，隨機(jī)在髁突軟骨前部、中部、后部各抽取切片，運(yùn)用光學(xué)顯微鏡對(duì)髁突軟骨前、中、后部進(jìn)行觀測(cè)，每部分選擇連續(xù)3個(gè)64px×64px大小的區(qū)域，計(jì)數(shù)各區(qū)域VEGF棕色深染的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，最終得出其陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3.4 Western Blot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)：石蠟包埋的髁突軟骨組織，用PBS溶液洗滌三次，切碎處理加入1ml裂解液，測(cè)定組織中的蛋白質(zhì)濃度，用100V的SDS-PAGE電泳，采用Bradford法實(shí)施定量，電泳后收集產(chǎn)物，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，10%山羊血清封閉0.5 h。一抗過(guò)夜孵育4℃條件下，二抗室溫下孵育1 h，洗膜在室溫下進(jìn)行，次數(shù)3次，β-actin作內(nèi)參，用Quantity one 4.0軟件分析VEGF蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，所有數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，兩組對(duì)比行t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 兩組髁突軟骨生長(zhǎng)發(fā)育情況：建模前兩組髁突軟骨各部厚度對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;建模后實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨各部厚度均較對(duì)照組更厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組髁突軟骨組織形態(tài)對(duì)比：實(shí)驗(yàn)組軟骨前、中、后部增殖層細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組均有所上升，細(xì)胞核有明顯變大，成熟層細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)增長(zhǎng)，肥大層細(xì)胞數(shù)量、分泌量與對(duì)照組相比呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，軟骨中部、后部纖維層變化不明顯。見(jiàn)圖2。

2.3 免疫組化染色：VEGF在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中表達(dá)為棕黃色，兩組后部陽(yáng)性表達(dá)率均高于中部，中部陽(yáng)性表達(dá)率均高于前部，其中，對(duì)照組髁突軟骨前部、中部、后部VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均低于實(shí)驗(yàn)組。見(jiàn)圖3。

2.4 兩組大鼠髁突軟骨前部、中部、后部的VEGF蛋白表達(dá)變化：兩組髁突軟骨前部VEGF表達(dá)對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;實(shí)驗(yàn)組大鼠髁突軟骨中部和后部VEGF表達(dá)均較對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.675，6.057，均P<0.05）。兩組髁突軟骨前部VEGF蛋白表達(dá)最低，中部蛋白表達(dá)其次，后部蛋白表達(dá)最高，各部對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)圖4。

3? 討論

誘導(dǎo)下頜前伸的功能性矯治器可用于矯正Ⅱ類錯(cuò)牙合[8]。骨髁突關(guān)節(jié)的髁突軟骨和關(guān)節(jié)盤重建，反映外力對(duì)髁突產(chǎn)生的各種影響[9]。髁突軟骨受到外力刺激，影響增殖細(xì)胞最終分化為成熟軟骨細(xì)胞[10]。成熟的軟骨細(xì)胞層連續(xù)分泌細(xì)胞外基質(zhì)，在這個(gè)過(guò)程中逐漸分化成肥大層軟骨細(xì)胞，與軟骨下相鄰的肥大層骨骼形成活化，軟骨細(xì)胞鈣化變成下層的骨組織。突出的組織持續(xù)成長(zhǎng)，并且成年后也維持一定的重建能力[11]。而VEGF是下頜骨軟骨的成長(zhǎng)及發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，VEGF在軟骨和骨的接合部對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起作用，促進(jìn)血管形成，并誘導(dǎo)小血管向軟骨肥大層生長(zhǎng)，提供對(duì)髁突軟骨成長(zhǎng)和發(fā)育必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]。

有研究證實(shí)，軟骨內(nèi)骨化的過(guò)程與軟骨所受外力的變化密切相關(guān)，下顎前伸使下頜骨的位置發(fā)生變化，髁突軟骨局部承受力發(fā)生改變，誘導(dǎo)軟骨組織產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)。有研究證實(shí)，下顎前伸、髁突變位后，促進(jìn)鈣化軟骨中內(nèi)骨化形成，導(dǎo)致肥大軟骨細(xì)胞也呈鈣化趨勢(shì)且形成速度較快，細(xì)胞鈣化成骨組織，因此髁突組織局部發(fā)育、生長(zhǎng)加快[13-14]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，功能矯形的大鼠髁突局部生長(zhǎng)加快，軟骨較對(duì)照組厚，軟骨增殖層細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組有所上升，細(xì)胞核有明顯變大，成熟層細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)增長(zhǎng)，肥大層細(xì)胞數(shù)量、分泌量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，軟骨中部、后部纖維層變化不明顯。結(jié)果提示功能矯形對(duì)髁突軟骨生長(zhǎng)發(fā)育具有明顯的改善作用。這與之前的報(bào)道相符。

VEGF是軟骨細(xì)胞凋亡、破骨細(xì)胞功能、細(xì)胞外基質(zhì)變化、血管新生及骨骼形成的重要調(diào)整因子。VEGF可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管形成來(lái)參與骨骼形成及骨組織治愈的過(guò)程，內(nèi)因性VEGF可以促進(jìn)血管形成、骨痂形成及鈣化，伴隨骨骼形成及骨膜下骨形成加速骨達(dá)到愈合的效果。有研究證實(shí)，小鼠VEGF基因的敲除后，阻礙血管侵入軟骨，說(shuō)明VEGF在軟骨血管化的初期階段及后期階段發(fā)揮重要作用，并在關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞死亡，說(shuō)明VEGF表達(dá)水平與軟骨的生長(zhǎng)十分重要[15]。本研究中，筆者觀察到軟骨中，VEGF的陽(yáng)性表達(dá)及蛋白表達(dá)從前部到后部均遞增，且功能矯形后的大鼠相對(duì)于對(duì)照組，VEGF在軟骨不同部位的表達(dá)均顯著升高。以上結(jié)果提示，功能矯形有助于提高大鼠軟骨VEGF表達(dá)，以促進(jìn)軟骨的形成。

綜上所述，功能矯形可促進(jìn)安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合大鼠下頜髁突軟骨局部生長(zhǎng)，提高VEGF表達(dá)。

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[收稿日期]2020-11-06

本文引用格式：鄭新宇.功能矯形對(duì)安氏Ⅱ類錯(cuò)牙合模型大鼠髁突軟骨生長(zhǎng)發(fā)育及VEGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2022，31（3）：103-106.