組蛋白去乙酰化酶4在大鼠骨關節(jié)炎軟骨退變中的變化趨勢及作用

顧曉東 李鵬翠 李飛

1.山西白求恩醫(yī)院骨科，山西 太原 030032 2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，骨與軟組織損傷修復山西省重點實驗室，山西 太原 030001

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是中老年人常見的關節(jié)疾病，因關節(jié)疼痛和功能障礙，嚴重影響患者的日常生活[1]。關節(jié)軟骨退行性變是OA最顯著的病理特征，隨著病變的進展，會繼發(fā)出現(xiàn)關節(jié)周圍骨質增生，關節(jié)畸形，最終導致關節(jié)疼痛及功能喪失[2-3]。雖然在不斷地進行研究，但是關節(jié)軟骨退變的機制不清楚，目前尚未有有效的方法延緩或者逆轉關節(jié)軟骨退變的發(fā)生。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，OA人群肥大化軟骨細胞在關節(jié)軟骨中的占比增高，這種細胞會大量分泌蛋白酶降解基質，最終破壞軟骨，引起嚴重關節(jié)功能障礙[4]。

組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)是調控軟骨細胞發(fā)生肥大樣表型變化的關鍵酶類，其可以抑制Runx-2的表達，進而抑制軟骨細胞發(fā)生肥大樣改變[5-6]。研究表明，OA患者關節(jié)軟骨組織HDAC4的含量較正常軟骨組織明顯降低[7]。然而其在OA發(fā)生發(fā)展過程中的變化趨勢和與關節(jié)軟骨損傷程度之間的關系并不清楚。本研究擬通過構建大鼠膝關節(jié)OA模型，研究OA發(fā)生發(fā)展過程中HDAC4及其下游分子Runx-2的變化規(guī)律及其與關節(jié)軟骨退變的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

54只8周齡雄性SD大鼠，購自山西醫(yī)科大學動物部，實驗通過了倫理審查，并且符合相關部門關于實驗動物管理和使用規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶及番紅染色劑購自美國Sigma公司；IL-1β購自PeproTech公司；HDAC4一抗購自美國Proteintech公司；Runx-2一抗購自北京博奧森公司；免疫組化試劑購自北京中杉金橋公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉錄、PCR試劑購自日本TAKARA公司；熒光定量PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 軟骨細胞分離培養(yǎng)

出生3 d內(nèi)的SD大鼠乳鼠，脫頸處死，75%乙醇浸泡消毒。分離乳鼠胸廓組織，PBS清洗3次，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化90 min，更換0.05% Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化3 h，過濾并收集消化液，低速離心10 min，沉淀為軟骨細胞團，PBS漂洗及離心后，用含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基吹打混勻，按照105個/cm2接種，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)[8]。

1.4 體外OA模型

第2代軟骨細胞分為實驗組和對照組，細胞生長至60%～70%時，實驗組加入IL-1β，使其在培養(yǎng)液中的濃度為10 ng/mL，對照組加等體積無菌PBS緩沖液，48 h后行Western blot檢測HDAC4和Runx-2的表達。

1.5 Western blot檢測

提取細胞全蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，室溫封閉2 h。添加HDAC4(1∶500)、Runx-2(1∶500)抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜，然后加入稀釋的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。再次用TBST洗膜，超敏ECL顯色并攝取圖像。Image Lab軟件分析條帶灰度值，β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

1.6 實驗動物分組與手術

54只8周齡雄性SD大鼠，隨機分為假手術組(n=27)和前交叉韌帶切斷(ACLT)組(n=27)。手術簡述：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉 (1 mL/100 g)麻醉。右膝消毒后鋪無菌單。切開皮膚，采用髕內(nèi)切口，切開關節(jié)腔，采用11號尖刀片切斷ACL，抽屜試驗陽性代表手術成功。假手術組只切開關節(jié)囊。

1.7 動物取材

術后2、4、8周兩組各取9只大鼠過量麻藥安樂處死，取右膝關節(jié)，脛骨平臺做番紅固綠及免疫組化檢測，股骨髁軟骨用于RT-qPCR實驗[8]。

1.8 番紅固綠染色及OARSI評分

大鼠脛骨平臺通過4%多聚甲醛常溫固定，10% EDTA脫鈣6周，制備6 μm組織切片。脫蠟至水，蘇木素染色1 min，流水清洗后鹽酸酒精分化15 s，再次清洗2 min。0.05%固綠染色5 min，1%乙酸酸化。蒸餾水清洗后，0.5%番紅O染色2 min。脫水透明，封片。關節(jié)軟骨損傷程度采用OARSI評分[9]。

1.9 免疫組織化學染色

制備大鼠脛骨平臺6 μm組織切片，脫蠟至水，3% H2O2使內(nèi)源性過氧化物酶失活，加入酶消化液行抗原修復，滴加HDAC4(1∶50)、Runx-2(1∶50)抗體，37 ℃孵育120 min；PBS沖洗后加入羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染。

1.10 RT-qPCR檢測

將大鼠股骨髁軟骨用刀片切下，每3只大鼠股骨髁軟骨混合成一份樣本，共3份樣本。TRIzol試劑提取關節(jié)軟骨中的總RNA，然后逆轉錄為cDNA。在QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR儀，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ進行兩步法RT-qPCR反應?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt方法進行計算。引物序列：18SrRNAF: GATGCGGCGGCGTTATT CCC ，R: GTGGTGCCCTTCCGTCAATTCC；HDAC4 F: GGCTTCCTTGTGGTGGTGTTGG ，R: TGTACTCTCCT CGGCATGGTGTC；Runx-2 F: AACAGCAGCAGCAG CAGCAG ，R: GCACGGAGCACAGGAAGTTGG。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 體外OA模型HDAC4和Runx-2的蛋白表達量

Western blot表明，實驗組(IL-1β組)細胞HDAC4的表達量較對照組細胞降低(P<0.05)，而Runx-2的表達量較對照組升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組細胞HDAC4和Runx-2蛋白表達情況Fig.1 Protein expression of HDAC4 and Runx-2 in each group注：和對照組比較，*P<0.05。

2.2 不同時間點大鼠關節(jié)軟骨番紅固綠染色及OARSI評分

番紅固綠染色結果表明，前交叉韌帶切斷組脛骨平臺軟骨在2周時可見軟骨表面尚平整，未見明顯關節(jié)軟骨破壞，但軟骨表面開始纖維化，軟骨表層番紅著色淺；4周時軟骨表面開始出現(xiàn)裂隙，番紅著色進一步減少，8周時軟骨表層破壞明顯，裂隙延伸到軟骨中層，部分區(qū)域軟骨細胞呈簇狀增生，番紅染色明顯減少。各時間點假手術組的軟骨表面完整，番紅著色均勻。OARSI評分結果顯示，與假手術組相比，前交叉韌帶切斷組各時間點評分均升高(P<0.05)。各時間點假手術組評分差異不明顯；前交叉韌帶切斷組評分隨時間延長升高(P<0.05)(圖2)。

圖2 假手術組和前交叉韌帶切斷組不同時間點番紅固綠染色及OARSI評分結果(×100，標尺：100 μm)Fig.2 Safranin O/Fast green staining and OARSI scores at different time points in Sham and anterior cruciate ligament transection group (×100, scale bar: 100 μ m)注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05。

2.3 大鼠關節(jié)軟骨HDAC4和Runx-2免疫組織化學染色結果

免疫組化結果顯示，前交叉韌帶切斷組脛骨平臺軟骨HDAC4陽性染色細胞隨著造模時間延長，其數(shù)量逐漸降低，而Runx-2陽性染色細胞數(shù)隨著造模時間的延長，其數(shù)量逐漸增加，各時間點差異明顯(P<0.05)。假手術組作為對照組，雖然HDAC4的表達隨時間推移有所降低，Runx-2的表達隨著造模時間延長有所增加(P<0.05)，但不如前交叉韌帶切斷組明顯(圖3、4)。

圖3 各組不同時間點HDAC4免疫組化染色結果(×200)Fig.3 Immunohistochemical staining of HDAC4 at different time points in each group (×200)注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術組比較，^P<0.05；和4周假手術組比較，%P<0.05。

圖4 各組不同時間點Runx-2免疫組化染色結果(×200)Fig.4 Immunohistochemical staining of Runx-2 at different time points in each group (×200)注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術組比較，^P<0.05；和4周假手術組比較，%P<0.05。

2.4 大鼠關節(jié)軟骨HDAC4、Runx-2 mRNA表達量

RT-qPCR結果顯示，在相同時間點內(nèi)，ACLT組HDAC4的表達較假手術組降低，Runx-2的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組內(nèi)比較，ACLT組HDAC4的表達隨時間推移逐漸降低，Runx-2的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術組HDAC4、Runx-2的表達隨時間推移雖有差異，但沒有ACLT組明顯(圖5)。

圖5 各組不同時間點HDAC4和Runx-2 mRNA的表達比較Fig.5 Comparison of HDAC4 and Runx-2 mRNA expression at different time points between each group注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術組比較，^P<0.05；和4周假手術組比較，%P<0.05。

3 討論

軟骨細胞是關節(jié)軟骨中僅有的細胞種類，其散在分布于關節(jié)軟骨基質中，軟骨細胞在維持軟骨的正常合成和降解代謝中十分關鍵[10]。軟骨細胞表型及其功能的改變會破壞軟骨的代謝穩(wěn)定性，從而破壞軟骨正常的生物力學性能，最終導致關節(jié)軟骨損傷。在OA病變軟骨進行性退變破壞過程中，軟骨細胞發(fā)生了肥大樣改變。肥大的軟骨細胞表達Runx-2、MMP-13等因子水平升高，導致軟骨破壞[11-12]。其中，Runx-2在調控細胞肥大表型中起關鍵作用[13]。Runx-2可以促進其下游MMP-13、ADAMTS5等軟骨基質降解酶類的表達，破壞軟骨基質，從而促進骨關節(jié)炎的進展[14]。在小鼠膝關節(jié)不穩(wěn)定OA模型中，通過條件性敲除軟骨細胞Runx-2基因，其下游MMP-9、13和ADAMTS4、5、7、12的表達降低，從而延緩OA關節(jié)軟骨退變。另外，Runx-2對成骨細胞分化起到關鍵作用[15]，因此在OA進程中，Runx-2的變化同樣會影響軟骨下骨的改變。由于關節(jié)軟骨與軟骨下骨之間可能存在密切的關系和相互作用，因此，將小鼠軟骨中的Runx2敲除，這種小鼠不但軟骨降解受到抑制，軟骨下骨硬化亦得到好轉[16]。

HDAC4是Runx-2的上游分子，它可以與Runx-2啟動子結合，抑制其轉錄，使其在細胞內(nèi)的表達下調，從而起到抑制軟骨細胞發(fā)生肥大表型改變的作用[8]。提高細胞中HDAC4的表達水平，可起到與Runx-2敲除相同的抑制軟骨細胞肥大化及后續(xù)的軟骨內(nèi)成骨的效果[17]。HDAC4敲基因鼠由于喪失了其抑制Runx-2的作用，促進了軟骨細胞肥大樣改變的進程，從而導致小鼠骨骼提前發(fā)生礦化[5]。另外，HDAC4作為去乙?；?，具有去乙?；拿富钚?，由于其特殊的核內(nèi)外定位序列，其具有核質穿梭的能力，可通過其核質穿梭機制，使Runx-2發(fā)生去乙酰化，從而加速其降解[18]。

本研究通過體外細胞OA模型及大鼠前交叉韌帶切斷體內(nèi)OA模型，并在造模的不同時間點選取大鼠處死，通過番紅染色、免疫組化及PCR等實驗方法研究了HDAC4及其下游Runx-2在OA發(fā)生發(fā)展過程中的變化趨勢以及其對軟骨退變的影響。從而有助于對這兩種軟骨細胞肥大相關關鍵分子在OA中的作用進行深入的了解。本實驗中，體外OA模型條件下，HDAC4的表達降低，而Runx-2的表達升高。大鼠前叉切斷OA模型結果表明，隨著術后時間不斷增加，即骨關節(jié)炎軟骨退變程度的不斷加重，HDAC4的表達量持續(xù)下降，而Runx-2的表達持續(xù)增高。這說明HDAC4的降低和Runx-2的表達升高參與了OA的病理進程，這種變化可能是由于在OA發(fā)生發(fā)展過程中，HDAC4的表達量不斷降低，其對Runx-2的抑制作用持續(xù)減弱，導致軟骨細胞發(fā)生肥大樣改變。本研究通過番紅固綠染色評價了OA發(fā)生和進展過程中蛋白聚糖丟失和軟骨破壞情況。結果顯示，隨著術后時間的增加，番紅著色逐漸變淺，且從軟骨表面染色淺逐漸過渡到軟骨中深層染色淺，從軟骨表面粗糙、纖維化進展到軟骨裂隙出現(xiàn)，軟骨面皸裂，破壞。這表明隨著軟骨細胞發(fā)生肥大樣改變，軟骨正常的代謝平衡遭到破壞，從而導致OA的不斷進展。OARSI是一種半定量評分，定義為OA分級與OA分期相結合的評估，OARSI分數(shù)為0～24分，評分越高，代表軟骨損傷越嚴重[9]。在番紅固綠染色的基礎上，本研究對OA進展過程中軟骨損傷的程度進行了評分，研究表明，隨著時間推移，OARSI評分逐漸升高，OA關節(jié)軟骨退變在不斷進展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在OA發(fā)生和進展過程中，HDAC4含量的不斷降低，而其下游Runx-2的表達逐漸增加，導致軟骨細胞發(fā)生肥大樣改變，軟骨正常的代謝穩(wěn)定遭到破壞，導致OA關節(jié)軟骨退變。本研究的不足之處在于：前交叉韌帶切斷模型是一種關節(jié)不穩(wěn)定模型，并不能完全模擬OA發(fā)生和進展的病理過程，后續(xù)將探索更好的動物模型來模擬OA的病理進程，更好地闡明OA的發(fā)病機制。另外，后續(xù)將進行更詳細的細胞實驗來驗證在OA病理進程中，HDAC4對Runx-2的調控作用，為OA的防治提供理論依據(jù)。