甲狀腺乳頭狀癌患者血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平變化及其診斷效能

劉穎，查衛(wèi)娜，楊曉琳，姜泰先，劉閣玲，王茜

1蘇州大學附屬第一醫(yī)院感染科，江蘇蘇州 215000；2唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌一科；3華北理工大學附屬工人醫(yī)院內(nèi)分泌一科

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤［1］，其中以甲狀腺乳頭狀癌（PTC）最為常見，占85%～90%［2］。PTC經(jīng)治療預后良好，但局部復發(fā)率為2%～6%，遠處轉(zhuǎn)移率為1%～2%［3］，仍有0.5%的患者可能死于甲狀腺微小乳頭狀癌［4］。早期診斷有助于改善PTC患者的預后［5］。甲狀腺細針穿刺細胞學檢查為最常用的PTC術(shù)前確診手段［6-7］，然而對于15%～30%的患者，甲狀腺細針穿刺檢查無法進行細胞形態(tài)學鑒別［8］。近年來，分子標志物在甲狀腺結(jié)節(jié)臨床診斷方面逐漸顯示出優(yōu)勢［9-11］。多項研究表明，miRNA可作為PTC診斷的分子標志物［12-15］。本課題組前期研究通過TCGA（癌癥基因組圖譜）數(shù)據(jù)庫篩選出PTC組織中表達差異性最顯著的2個miR即hsa-miR-4709-3和hsa-miR-34a-5p，并驗證了PTC組織中hsa-miR-4709-3、hsa-miR-34a-5p表達高于癌旁組織。本研究進一步觀察了PTC患者血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平變化，并分析兩項指標對PTC的診斷效能。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組選取2020年1月—10月于唐山市工人醫(yī)院就診并接受手術(shù)治療的甲狀腺結(jié)節(jié)患者納入研究。根據(jù)手術(shù)病理檢查結(jié)果分為PTC組和良性結(jié)節(jié)組，各50例。收集兩組患者血清備檢。本研究已獲得患者知情同意，獲唐山市工人醫(yī)院倫理委員會審批通過。PTC組、良性結(jié)節(jié)組年齡分別為（43.22±12.23）、（46.40±14.30）歲，BMI分別為（24.27±3.19）、（25.20±2.75）kg/m2。PTC組、良性結(jié)節(jié)組結(jié)節(jié)最大徑差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PTC組與良性結(jié)節(jié)組一般臨床資料比較（例）

1.2 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p檢測采用實時熒光定量PCR法。miR-4709-3p引物序列為5＇-TTGAAGAGGAGGTGCTCTGTAGC-3＇，miR-34a-5p引物序列為5＇-GGTGTGGGCTGGCAGTGTCTT-3＇，內(nèi)參U6引物序列為5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇。引物由上海生工生物工程股份有限公司提供。采用miR提取試劑盒提取樣本總miR，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用miRcute miR Detection Kit（SYBR Green）試劑盒（含miR通用引物）檢測血清中的miR-4709-3p、miR-34a-5p。PCR反應條件：94℃2 min，94℃20 s、60℃30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示miR-4709-3p、miR-34a-5p相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。收集兩組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓病史、身高、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、甲狀腺結(jié)節(jié)最大徑等資料；收集PTC組患者病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和TNM分期等資料。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（IQR）表示，組間比較比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。多因素分析采用Logistic回歸模型。采用受試者工作特征（ROC）曲線進行診斷效能檢驗：以術(shù)后病理結(jié)果為“金標準”，用Medcalc軟件繪制ROC曲線并計算曲線下面積（AUC），根據(jù)ROC曲線上的標準值和坐標篩選兩種miR判斷結(jié)節(jié)良惡性的截斷值，計算敏感度、特異度以評價診斷的真實性，計算Kappa值評價診斷結(jié)果與“金標準”的一致性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平比較PTC組、良性結(jié)節(jié)組血清miR-4709-3p水平分別為9.106（8.96）、1.498（1.40），miR-34a-5p水平分別為3.622（2.55）、1.226（0.64），PTC組血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平均高于良性結(jié)節(jié)組（P均＜0.05）。

2.2 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p與PTC發(fā)病的關(guān)系以甲狀腺結(jié)節(jié)患者病理檢查結(jié)果良惡性為因變量，血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平及甲狀腺結(jié)節(jié)最大徑為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-4709-3p（OR=2.106，95%CI1.406～3.157）、miR-34a-5p（OR=4.700，95%CI2.008～10.998）水平是PTC的影響因素。見表2。

表2 PTC影響因素的Logstic回歸分析結(jié)果

2.3 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p對PTC的診斷效能血清miR-34a-5p診斷PTC的AUC為0.910（95%CI0.837～0.958），考慮PTC是惡性疾病，應提高敏感度，減少漏診，故取1.765為截斷值進行診斷試驗評價；與病理檢查結(jié)果相比，血清miR-34a-5p診斷PTC的靈敏度為92.0%、特異度為86.0%、約登指數(shù)為0.78、Kappa值為0.78，血清miR-34a-5p檢測的診斷結(jié)果與病理檢查結(jié)果一致性較高。血清miR-4709-3p診斷PTC的AUC為0.924（95%CI0.853～0.976），選擇敏感度提高至90.0%時的截斷值2.395進行診斷試驗評價；血清miR-4709-3p診斷PTC的靈敏度為90.0%、特異度為80.0%、約登指數(shù)為0.70，Kappa值為0.70，血清miR-4709-3p檢測的診斷結(jié)果與病理檢查結(jié)果一致性一般。見圖1、表3、表4。

圖1 血清miR-34a-5p、miR-4709-3p診斷PTC的ROC曲線

表3 血清miR-34a-5p檢測對PTC的診斷效能（例）

表4 血清miR-4709-3p檢測對PTC的診斷效能（例）

3 討論

循環(huán)miR作為非侵入性分子標志物，在甲狀腺癌的診斷中有重要研究價值［16-19］。有學者對甲狀腺癌外泌體miR譜進行分析，認為外泌體miR-5189-3p對PTC的診斷效能最佳［20］。LIANG等［21］分析了血漿miRs對PTC的診 斷效 能，認 為miR-16-2-3p、miR-223-5p等是區(qū)分PTC和甲狀腺良性結(jié)節(jié)的最有力的生物標志物。在甲狀腺癌循環(huán)miRs相關(guān)研究中，針對血清miR-34a-5p鑒別PTC和良性結(jié)節(jié)的研究較為少見。本課題組前期研究篩選出hsa-miR-4709-3和hsa-miR-34a-5p在PTC組織中表達差異顯著，驗證了PTC組織中hsa-miR-4709-3、hsa-miR-34a-5p表達高于癌旁組織。本研究在此基礎上，進一步觀察了PTC患者血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平變化，結(jié)果顯示，PTC患者血清miR-34a-5p、miR-4709-3p水平高于良性結(jié)節(jié)組，提示miR-34a-5p、miR-4709-3p可能與PTC的發(fā)病有關(guān)，有望成為PTC的診斷標志物。

本研究中，PTC組和良性結(jié)節(jié)組的結(jié)節(jié)最大徑差異有統(tǒng)計學意義，而高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、結(jié)節(jié)家族史、性別、年齡、BMI等臨床變量差異無統(tǒng)計學意義，避免了研究結(jié)果因一般臨床信息分布不均勻而產(chǎn)生誤差。進一步以甲狀腺結(jié)節(jié)患者病理檢查結(jié)果良惡性為因變量，以血清miR-4709-3p、miR-34a-5p水平及結(jié)節(jié)最大徑為自變量，進行多因素Logstic分析，結(jié)果顯示，血清miR-4709-3p、miR-34a-5p是PTC的影響因素，可能有助于鑒別PTC與良性甲狀腺結(jié)節(jié)。

結(jié)合PTC的疾病特點，綜合考慮PTC的疾病自然病程與手術(shù)收益，在選擇早期診斷方法時，應盡量減少漏診，診斷方法應有比較高的敏感度。根據(jù)本研究中血清miR-34a-5p、miR-4709-3p診斷PTC的ROC曲線，選擇敏感度較高時的截斷值（分別為1.765、2.395）進行診斷試驗評價。以血清miR-34a-5p水平＞1.765作為診斷PTC的依據(jù)時，其診斷結(jié)果與術(shù)后病理診斷結(jié)果相比，靈敏度為92.0%、特異度為86.0%、約登指數(shù)為0.78、Kappa值為0.78，說明血清miR-34a-5p檢測對PTC的診斷效能較好，與病理檢查結(jié)果一致性較高。以血清miR-4709-3p水平＞2.395作為診斷PTC的依據(jù)時，其診斷結(jié)果與術(shù)后病理診斷結(jié)果相比，靈敏度為90.0%、特異度為80.0%、約登指數(shù)為0.70，Kappa值為0.70，血清miR-4709-3p檢測對PTC有一定診斷效能，但診斷結(jié)果與病理診斷結(jié)果一致性較miR-34a-5p檢測略有下降。

分析本研究結(jié)果，我們認為，血清miR-34a-5p、miR-4709-3p均有一定的鑒別PTC與良性甲狀腺結(jié)節(jié)的效能，且血清miR-34a-5p效能略優(yōu)于miR-4709-3p。但考慮到本研究納入樣本量較少，病例收集的范圍較局限，對于診斷試驗的評價及分析結(jié)果有一定的波動性，后期應擴大樣本量，進行多中心、大樣本的更加穩(wěn)定的評價試驗。雖然本研究結(jié)果尚不能說明血清miR-34a-5p可單獨用于PTC的早期診斷，但以上研究結(jié)果為早期PTC無創(chuàng)診斷方法的相關(guān)研究提供了新的補充和提示。未來可進行大樣本及甲狀腺細針穿刺標本實驗，擴大并完善預后價值的分析，并可聯(lián)合更多特異的miRs進行檢測，或聯(lián)合多模態(tài)超聲檢查及其他無創(chuàng)診斷方式進行診斷價值分析，采用多中心實驗驗證以上結(jié)論，繼續(xù)篩選和發(fā)現(xiàn)其他具有研究價值的生物標志物，指導精準醫(yī)療。