柔嫩梭菌灌胃的高鹽飲食小鼠血清炎癥因子及糞便腸道菌群、短鏈脂肪酸水平觀察

雷超，劉聰，劉志華

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院前沿醫(yī)學(xué)交叉研究中心廣東高校生物靶向診治與康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510700；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院肛腸科

中國(guó)人群平均攝鹽量達(dá)12.5 g，顯著高于世界衛(wèi)生組織推薦（5 g）［1］。高鹽攝入對(duì)免疫系統(tǒng)的影響是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［2］。高鹽攝入與炎癥反應(yīng)之間的聯(lián)系可能是多種疾病持續(xù)惡化的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，高鹽攝入與腸道菌群失調(diào)產(chǎn)生協(xié)同作用，可進(jìn)一步加重免疫紊亂［3］。柔嫩梭菌是寄生于人類(lèi)腸道的益生菌，可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生短鏈脂肪酸［4-5］。研究顯示，柔嫩梭菌在多種免疫性疾病中發(fā)揮抗炎效應(yīng)，如支氣管哮喘［5］、炎癥性腸?。?］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高鹽飲食顯著減少了小鼠腸道菌群中柔嫩梭菌的相對(duì)豐度［7］，而柔嫩梭菌對(duì)高鹽飲食誘導(dǎo)的免疫紊亂的影響有待進(jìn)一步探索。2021年1月—5月，本研究觀察了柔嫩梭菌灌胃的高鹽飲食小鼠血清炎癥因子及糞便中腸道菌群、短鏈脂肪酸水平變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠16只，6周齡，體質(zhì)量19～20 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于（22±2）℃恒溫動(dòng)物房、每天12 h光照條件下飼養(yǎng)。老鼠高鹽飼料（8%NaCl）購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。柔嫩梭菌購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）菌種保存中心，接種于ATCC1490培養(yǎng)基中，并于含0.1% O2、10% CO2、10% H2和80%N2的厭氧箱中培養(yǎng)。白細(xì)胞介素（IL）1B、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理方法將16只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只。兩組均給予高鹽飼料喂養(yǎng)16周。實(shí)驗(yàn)組同時(shí)以柔嫩梭菌菌體懸液（109CFU/mL）2 mL每隔1 d灌胃，對(duì)照組以超純水2 mL每隔1 d灌胃。

1.3 血清IL-1B、IL-6、TNF-α檢測(cè)采用EUSA法。使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈取血，收集血液于采集管中并置于碎冰上保存，隨后4 000 r/min離心12 min得到血清。將兩組小鼠血清依次加入ELISA檢測(cè)用96孔板，分別加入抗小鼠IL-1B、IL-6、TNF-α，避光孵育30 min，PBS清洗。隨后依次加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的生物素化二抗、TMB和TMB終止液。最后用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品濃度。

1.4 糞便腸道菌群檢測(cè)采用高通量測(cè)序法進(jìn)行16S rDNA基因V4片段的基因測(cè)序。收集兩組小鼠新鮮糞便，置于標(biāo)準(zhǔn)冷凍管，液氮保存。樣本檢測(cè)由北京百邁客生物科技有限公司完成。提取糞便樣本細(xì)菌總DNA，置于-80℃冰箱凍存。對(duì)DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)全長(zhǎng)引物序列合成帶有Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用PacBio Sequel進(jìn)行測(cè) 序。PacBio Sequel下 機(jī)數(shù)據(jù) 為bam格式，通過(guò)smrtlink分析軟件導(dǎo)出CCS文件，根據(jù)Barcode序列識(shí)別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)化為fastq格式數(shù)據(jù)；將PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出為CCS文件后，使用lima1.7.0軟件，通過(guò)barcode對(duì)CCS進(jìn)行識(shí)別，得到的Raw-CCS序列數(shù)據(jù)；使用cutadapt1.9.1軟件進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除并進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾，得到不包含引物序列的Clean-CCS序列；使用UCHIME4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective-CC序列；將Effective-CCS用于Feature（OTUs、ASVs）、多樣性分析、差異分析。

1.5 糞便短鏈脂肪酸定量檢測(cè)由深圳微科盟科技生物公司完成。將兩組小鼠糞便（約100 mg）解凍并懸浮，加入15%磷酸50μL、125μg/mL的內(nèi)標(biāo)（異己酸）溶液100μL、乙醚400μL進(jìn)行勻漿1 min，然后以12 000 r/min離心10 min。將上清液通過(guò)0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。隨后取1μL液體進(jìn)行GC-MS分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用QIIME2軟件分析腸道微生物群α多樣性，α多樣性指標(biāo)包括Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)。通過(guò)基于Bray-Curtis異質(zhì)性的偏最小二乘法進(jìn)行β多樣性分析。使用Metastats軟件比較兩組細(xì)菌相對(duì)豐度，P值由非參數(shù)檢驗(yàn)獲得。對(duì)P值進(jìn)行修正，獲取q值，最后根據(jù)P值（或q值）篩選出兩組樣品組成差異的物種，默認(rèn)P≥0.05。采用Metastats軟件的LefSe分析比較兩組細(xì)菌在屬種水平的相對(duì)豐度，進(jìn)一步通過(guò)線性判別分析（LDA）估計(jì)每個(gè)組成物種的豐度對(duì)差異效應(yīng)的影響程度，將顯著差異的對(duì)數(shù)LDA分?jǐn)?shù)設(shè)定為4.0，找到豐度差異顯著的物種。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平比較對(duì)照組血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平分別為（524.0±55.4）、（159.4±7.2）、（1 875.0±438.0）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組分別為（367.0±8.1）、（87.7±1.8）、（333.9±136.0）pg/mL。實(shí)驗(yàn)組血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平低于對(duì)照組（P均＜0.05）。

2.2 兩組小鼠糞便腸道菌群比較兩組共檢測(cè)出352個(gè)操作分類(lèi)單元（OTU），其中兩組共有243個(gè)OTU，兩組間菌群豐度差異較大。對(duì)照組獨(dú)有的OTU為36個(gè)，不受柔嫩梭菌灌胃影響；實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的OTU為73個(gè)，為受柔嫩梭菌灌胃影響而產(chǎn)生的。兩組的腸道菌群總體分布較為分散。見(jiàn)OSID碼圖1。實(shí)驗(yàn)組Chao1、Simpson指數(shù)高于對(duì)照組（P均＜0.05）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組擬桿菌門(mén)及變形菌門(mén)相對(duì)豐度增加，而厚壁菌門(mén)及疣微菌門(mén)相對(duì)豐度減少（P均＜0.05）。見(jiàn)表1、表2。鼠乳桿菌顯著富集于實(shí)驗(yàn)組，而機(jī)會(huì)致病菌木糖葡萄球菌、遲緩葡萄球菌顯著富集于對(duì)照組。見(jiàn)OSID碼圖2。

表1 兩組小鼠糞便腸道菌群α多樣性指標(biāo)比較（±s）

表1 兩組小鼠糞便腸道菌群α多樣性指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組n 8 8 Ace 201.5±10.5 163.3±19.1 Chao1 202.3±10.1*158.7±19.1 Simpson 0.92±0.0*0.75±0.0 Shannon 4.6±0.2 3.2±0.4

表2 兩組小鼠糞便腸道菌群門(mén)水平比較（%，±s）

表2 兩組小鼠糞便腸道菌群門(mén)水平比較（%，±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組n 8 8擬桿菌門(mén)34.0±2.0*17.2±3.2厚壁菌門(mén)43.9±3.4*54.4±3.5變形菌門(mén)5.4±1.5*1.5±0.8疣微菌門(mén)6.8±3.2*25.4±4.6其他9.8±3.1*1.4±0.5

2.3 兩組小鼠糞便短鏈脂肪酸水平比較GC-MS分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便丙酸、丁酸、異戊酸、己酸水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組小鼠糞便短鏈脂肪酸水平比較（μg/mL，±s）

表3 兩組小鼠糞便短鏈脂肪酸水平比較（μg/mL，±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組n 8 8乙酸165.10±18.87 160.43±10.67丙酸22.65±2.55*11.15±1.96異丁酸0.96±0.05 0.69±0.16丁酸15.67±2.25*6.48±1.26異戊酸1.20±0.20*0.50±0.10戊酸1.30±0.31 0.71±0.07己酸0.24±0.02*0.16±0.01

3 討論

飲食成分通過(guò)調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和腸道菌群組成影響健康，其中高鹽飲食被認(rèn)為與慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)［8-9］。研究表明，高鹽飲食可加重潰瘍性結(jié)腸炎和自身免疫性腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病的組織炎癥［3，10］，可能機(jī)制是高鹽飲食使巨噬細(xì)胞極化為M1表型并升高促炎介質(zhì)γ干擾素的水平。一項(xiàng)對(duì)健康人群參與者的縱向研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食與促炎單核細(xì)胞比例存在顯著的相關(guān)性［11］。高鹽飲食誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)和代謝改變，誘發(fā)組織炎癥［3，10］，因而人為補(bǔ)充缺乏的某種共生菌有望達(dá)到治療自身免疫疾病的目的，這也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。既往研究表明，高鹽飲食可減少小鼠腸道菌群中的柔嫩梭菌相對(duì)豐度［7］。柔嫩梭菌是腸道中最具優(yōu)勢(shì)的三種細(xì)菌之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其可維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)免疫系統(tǒng)成熟、減輕炎癥反應(yīng)［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充柔嫩梭菌后，小鼠腸道內(nèi)該菌的相對(duì)豐度無(wú)明顯增多，說(shuō)明通過(guò)灌胃方式并不一定能促進(jìn)柔嫩梭菌在腸道定植，另外也表明腸道菌群的高度復(fù)雜性。但高鹽飲食喂養(yǎng)小鼠的血清炎癥因子IL-1B、IL-6、TNF-α水平明顯降低，表明機(jī)體免疫反應(yīng)被抑制，機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

高鹽飲食小鼠的腸道菌群組成與正常鹽飲食喂養(yǎng)的小鼠存在顯著差異，其優(yōu)勢(shì)菌主要為厚壁菌門(mén)、毛螺菌科、瘤胃球菌科，而劣勢(shì)菌種為擬桿菌門(mén)、乳酸菌屬等［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠腸道菌群總體分布明顯不同，補(bǔ)充柔嫩梭菌顯著增加了小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度，表明柔嫩梭菌可提升腸道菌群整體的穩(wěn)定性。在門(mén)水平，補(bǔ)充柔嫩梭菌顯著增加了擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，并減少了厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度。厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)豐度比值增加不僅會(huì)影響機(jī)體的碳水化合物代謝，還被認(rèn)為是與炎癥過(guò)程相關(guān)的重要因素［15］。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)充柔嫩梭菌能夠改變這一炎癥表型。本研究中，實(shí)驗(yàn)組鼠乳桿菌顯著富集，對(duì)照組機(jī)會(huì)致病菌木糖葡萄球菌、遲緩葡萄球菌顯著富集。鼠乳桿菌作為一種潛在的益生菌，是最常見(jiàn)的乳酸菌株之一［16］，其通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活性在維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要作用［17］，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮抗炎作用［10，18］。上述結(jié)果表明，補(bǔ)充柔嫩梭菌可有效優(yōu)化高鹽飲食小鼠的腸道菌群構(gòu)成，減少機(jī)會(huì)致病菌，增加益生菌相對(duì)豐度，從而糾正高鹽飲食引起的腸道菌群相關(guān)炎癥表型。

腸道中的短鏈脂肪酸主要包括丙酸、丁酸、己酸等，其含量受到飲食、年齡等因素影響，并在很大程度上受到腸道菌群構(gòu)成的影響［19］。短鏈脂肪酸是腸道菌群和免疫系統(tǒng)之間交流的媒介。它們產(chǎn)生的信號(hào)通過(guò)游離脂肪酸受體在免疫細(xì)胞中傳遞，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［20］。短鏈脂肪酸不僅在腸道內(nèi)發(fā)揮局部作用，還可影響腸道免疫細(xì)胞，并通過(guò)炎癥小體調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組糞便中丙酸、丁酸、己酸水平顯著高于對(duì)照組。已有研究發(fā)現(xiàn)，服用丙酸、丁酸可降低壞死性小腸結(jié)腸炎模型小鼠血清炎癥因子IL-1B、IL-6水平。本研究結(jié)果表明，柔嫩梭菌灌胃顯著增加了丁酸等短鏈脂肪酸水平，推測(cè)補(bǔ)充柔嫩梭菌可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成，影響短鏈脂肪酸代謝，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。