腺苷預(yù)處理對大鼠腦組織缺血再灌注損傷的干預(yù)作用及其機制

栗延偉，曹武璟，季禾，譚軍

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南新鄉(xiāng) 453003；2河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

腦缺血再灌注（I/R）是指腦血管被阻塞后，腦組織處于持續(xù)缺血狀態(tài)，當(dāng)血流重新灌注后，會對缺血半暗帶區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞造成進(jìn)一步損傷，引發(fā)多種病理過程，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡［1］。腺苷能夠減輕腦缺血再灌注損傷（CIRI）［2-4］，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，但具體機制仍未明確［5-6］。根據(jù)文獻(xiàn)資料，我們考慮腺苷可能通過調(diào)控相關(guān)miRNA抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［7-9］。已有研究表明，腦組織中miRNA-125b表達(dá)量較高，與多種疾病過程中的細(xì)胞凋亡有關(guān)［10-11］。2021年1月—2022年5月，我們觀察了腺苷對大鼠CIRI的干預(yù)作用，并通過miRNA-125b及其下游因子B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、抑癌基因p53蛋白等探討相關(guān)機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料從新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物中心隨機選取180只體質(zhì)量250～280 g的健康成年雄性SD級大鼠，動物合格證號為SCXK（魯）20190003。大腦中動脈栓塞模型尼龍栓線購自北京CINONTECH有限公司，miRNA-125b、U6引物購自美國Invitrogen公司，腺苷、TTC試劑購自美國Sigma公司，Bcl-2、p-AKT、AKT、p53單克隆抗體購自北京Abcam公司。RNAiso for Small RNA、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，qRTPCR儀、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 動物分組及處理方法180只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、實驗組，每組60只。實驗組大鼠造模前3 d腹腔注射腺苷注射液，每次2 mL、每天1次；假手術(shù)組和模型組大鼠于同時點腹腔注射生理鹽水2 mL。模型組和實驗組采用改良線栓法制備大腦中動脈栓塞模型：以10%水合氯醛溶液3 mL/kg腹腔注射麻醉，切開皮膚及皮下組織，分離左側(cè)頸總動脈、左側(cè)頸外動脈和左側(cè)頸內(nèi)動脈，從頸總動脈插入栓線，經(jīng)頸內(nèi)動脈到大腦前動脈，機械性阻斷大腦中動脈發(fā)出處的血供；栓線插入后開始計時，2 h后依據(jù)5分制神經(jīng)行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損癥狀評分，將評分為1～3分的大鼠納入后續(xù)實驗，剔除0分或4分的大鼠；輕輕向外拔栓線約1 cm恢復(fù)血供。假手術(shù)組僅分離大腦中動脈，不進(jìn)行阻斷血供操作。如有大鼠剔除，按照先前的飼養(yǎng)條件、實驗方法進(jìn)行補充。

1.3 腦梗死體積占比測算術(shù)后24 h各組隨機選取10只大鼠，麻醉后斷頭取腦，立即以冰生理鹽水沖洗，放入冰箱速凍20 min。從額極開始，將整個大腦切成厚度約2 mm的冠狀切片，共5片，放入2%的TTC溶液中37℃孵育30 min，多次翻動。正常腦組織會被TTC染成紅色，梗死腦組織因無法與TTC發(fā)生反應(yīng)而呈現(xiàn)白色。用1×PBS溶液洗去浮色，拍照觀察并計算各組腦梗死體積占比。

1.4 海馬組織病理觀察術(shù)后24 h各組隨機選取10只大鼠，麻醉，撕去心包進(jìn)行心臟灌流固定，取出腦組織并用細(xì)胞固定液固定2 d，石蠟包埋，在海馬平面作冠狀連續(xù)切片，厚度4μm；經(jīng)脫蠟、下行梯度（100%、95%、85%、75%）乙醇水化后，加入蘇木精染色10 min，水洗后再經(jīng)1%鹽酸乙醇浸洗33 s，水洗后加入碳酸鋰水溶液10 s，入伊紅液染色3 min；水洗，用上行梯度（75%、85%、95%、100%）乙醇脫水、二甲苯透明，以中性樹膠封片。顯微鏡下觀察大鼠海馬組織病理學(xué)變化。

1.5 病灶腦組織中miRNA-125b檢測各組分別于術(shù)后2、6、24、48 h各取5只大鼠斷頭取腦，取相同位置病灶腦組織，用廣譜型miRNA提取試劑提取病灶腦組織中的總miRNA，將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用qRT-PCR法檢測miRNA-125b，以U6為內(nèi)參。miRNA-125b mimics序列為UCCCUGAGACCCUAACUUGUG，U6上游引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃變性20 s，62℃退火10 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。擴增完后進(jìn)行熔解曲線分析，每個樣本重復(fù)3次。以2-ΔΔCt表示miRNA-125b相對表達(dá)量。

1.6 病灶腦組織中Bcl-2、p53、p-AKT蛋白檢測各組分別于術(shù)后2、6、24、48 h各取5只大鼠斷頭取腦，取病灶腦組織，充分研磨。加入蛋白裂解液，于冰上反應(yīng)30 min，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。制備5%分離膠、10%濃縮膠進(jìn)行電泳，電泳開始時設(shè)置電壓80 V，進(jìn)入分離膠后調(diào)整為120 V。260 mA下轉(zhuǎn)移蛋白凝膠至PVDF膜上，時間90 min。TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶，室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗PVDF膜。加一抗4℃孵育過夜，GAPDH（1∶5 000）、AKT（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000），加二抗室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，化學(xué)發(fā)光試劑曝光。以GAPDH為內(nèi)參。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image J軟件定量分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用Graph Pad Prism8.0.2統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni's法；重復(fù)測量的計量資料比較采用重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦梗死體積占比比較假手術(shù)組、模型組、實驗組腦梗死體積占比分別為0、35.1%±4.0%、27.2%±5.0%。模型組、實驗組腦梗死體積占比高于假手術(shù)組，實驗組低于模型組（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠海馬組織病理變化假手術(shù)組海馬神經(jīng)元胞體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞變小，細(xì)胞核溶解，出現(xiàn)空泡，膜完整性破壞，細(xì)胞形態(tài)呈三角形或梭形，水腫明顯；實驗組神經(jīng)元病理改變較模型組明顯減輕，大部分細(xì)胞存活，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核及核仁較為完整清晰。見OSID碼圖1。

2.3 各組大鼠病灶腦組織miRNA-125b表達(dá)比較模型組和實驗組術(shù)后2、6、24、48 h的miRNA-125b表達(dá)高于假手術(shù)組，實驗組術(shù)后各時點miRNA-125b表達(dá)高于模型組（P均＜0.05）。模型組和實驗組大鼠術(shù)后腦組織miRNA-125b表達(dá)逐漸增高，模型組、實驗組分別于術(shù)后24、6 h達(dá)峰值，后逐漸下降（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時點病灶腦組織miRNA-125b表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時點病灶腦組織miRNA-125b表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與同組術(shù)后2 h相比，aP＜0.05；與同組術(shù)后6 h相比，bP＜0.05。

組別實驗組模型組假手術(shù)組n 5 5 5 miRNA-125b 2 h 0.742±0.026*#0.263±0.081*0.012±0.003 6 h 1.358±0.036*#a 0.646±0.026*a 0.013±0.006 24 h 0.615±0.052*#b 0.561±0.035*b 0.013±0.017 48 h 0.582±0.047*#b 0.543±0.045*b 0.014±0.006

2.4 各組大鼠病灶腦組織Bcl-2、p53、p-AKT蛋白表達(dá)比較詳見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后不同時點病灶腦組織Bcl-2、p53、p-AKT蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠術(shù)后不同時點病灶腦組織Bcl-2、p53、p-AKT蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與同時點假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與同時點模型組相比，#P＜0.05。

組別實驗組2 h 6 h 24 h 48 h模型組2 h 6 h 24 h 48 h假手術(shù)組2 h 6 h 24 h 48 h n 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Bcl-2蛋白0.25±0.05*#0.46±0.08*#0.99±0.03*#0.64±0.07*#0.19±0.04*0.37±0.05*0.64±0.06 0.53±0.03 0.17±0.05 0.16±0.03 0.17±0.05 0.18±0.08 p53蛋白1.40±0.05#1.95±0.03*#2.04±0.05*#1.63±0.03*#0.80±0.03*1.12±0.09 0.94±0.06 0.88±0.06 0.53±0.03 0.61±0.05 0.63±0.04 0.70±0.05 p-AKT蛋白0.74±0.05*#0.96±0.06*#1.70±0.03*#0.99±0.05*#0.63±0.06*0.73±0.05*1.43±0.08*0.80±0.04 0.52±0.05 0.50±0.09 0.63±0.04 0.59±0.09

3 討論

缺血性腦梗死發(fā)病趨于年輕化，再灌注治療仍然是臨床上治療缺血性腦梗死的主要措施［12］，但腦組織血供恢復(fù)會引發(fā)一系列復(fù)雜的病理過程，導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡，擴大腦梗死面積。在CIRI臨床防治工作中，學(xué)者們提出腦缺血預(yù)處理的治療理念：經(jīng)歷短暫腦缺血狀態(tài)，誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生多種內(nèi)源性保護(hù)機制［14］，從而提高腦組織對缺血的適應(yīng)能力［15］。但短暫性缺血預(yù)處理在臨床實踐中是不實際的，也不易被患者接受。本研究采用的腺苷預(yù)處理已被證實能夠從降低細(xì)胞代謝、擴張腦部血管［16］、抑制血小板聚集等途徑來減輕CIRI，但其機制復(fù)雜，有待進(jìn)一步探索［17-18］。

本研究結(jié)果顯示，模型組和實驗組大鼠均出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損癥狀，行為學(xué)評分及腦梗死面積顯著高于假手術(shù)組，實驗組神經(jīng)功能癥狀及腦梗死情況較模型組得到改善。腦組織病理檢查結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的腦神經(jīng)元破壞，而腺苷預(yù)處理后大鼠腦損傷顯著減輕，與文獻(xiàn)報道一致。

miRNA通過與mRNA的3'-UTR結(jié)合，降解或下調(diào)靶mRNA表達(dá)，由此激活或抑制多種下游靶蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞死亡過程，影響CIRI。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與大腦多種生理和病理過程，在精神疾病和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而通過補充外源性miRNA可以達(dá)到治療疾病的效果［19-20］。研究顯示，急性心肌梗死早期患者血漿miRNA-125b相對表達(dá)量迅速上升。然而，針對miRNA-125b與CIRI之間的關(guān)系研究較少。本研究檢測了腦I/R后2、6、24、48 h大鼠海馬組織miRNA-125b相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，假手術(shù)組miRNA-125b相對表達(dá)量在術(shù)后各時點差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明正常腦組織中miRNA-125b表達(dá)量較低，并且維持在相對穩(wěn)定的水平；模型組和實驗組術(shù)后各時點miRNA-125b表達(dá)均高于假手術(shù)組，峰值分別在術(shù)后24、6 h出現(xiàn)，這表明正常腦細(xì)胞發(fā)生CIRI時，會迅速引起miRNA-125b表達(dá)增加；實驗組術(shù)后各時點miRNA-125b表達(dá)高于模型組，提示腺苷可能促使miRNA-125b表達(dá)迅速增高而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

AKT具有CIRI后抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激后被激活，AKT磷酸化形成p-AKT并傳遞信號。Bcl-2是內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，其作為AKT信號通路下游的關(guān)鍵物質(zhì)，與CIRI后神經(jīng)元的存活有關(guān)。p53蛋白具有抗凋亡作用，可促進(jìn)細(xì)胞存活。本研究結(jié)果顯示，模型組和實驗組術(shù)后大鼠腦組織抗凋亡蛋白Bcl-2、p53表達(dá)增高，并于術(shù)后24 h達(dá)峰值，實驗組術(shù)后各時點Bcl-2、p53蛋白表達(dá)均高于模型組，與miRNA-125b表達(dá)趨勢一致；實驗組促凋亡蛋白p-AKT表達(dá)低于模型組，提示當(dāng)腦細(xì)胞發(fā)生CIRI時，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、p53蛋白表達(dá)增加，參與抗凋亡過程；而I/R本身會引起促凋亡蛋白p-AKT表達(dá)增高。上述研究結(jié)果提示，miRNA-125b可能通過降低腦細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化水平，促進(jìn)Bcl-2、p53蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮CIRI后抗細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，腺苷預(yù)處理對CIRI具有腦保護(hù)作用，可能因為腺苷在CIRI早期能夠促進(jìn)miRNA-125b表達(dá)，抑制AKT磷酸化水平，上調(diào)抗凋亡蛋白p53和Bcl-2表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究從基因組學(xué)層面上解釋了CIRI潛在的發(fā)病機制及腺苷的保護(hù)作用機制。后續(xù)實驗中，還可采用基因敲除動物及miRNA-125b激動劑和抑制劑進(jìn)行更深入的研究。