促炎癥消退介質(zhì)Maresin1對高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞纖維化的干預(yù)作用觀察

唐詩，萬明，高原

成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院核工業(yè)四一六醫(yī)院內(nèi)分泌科，成都 610051

糖尿病腎?。―N）突出病理表現(xiàn)為腎小球系膜病變，細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化［1］。持續(xù)高血糖作用會(huì)使腎小球內(nèi)葡萄糖濃度增高，導(dǎo)致DN進(jìn)展。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GluT-1）作為調(diào)節(jié)葡萄糖進(jìn)入腎臟細(xì)胞的主要載體，可調(diào)節(jié)葡萄糖濃度并激活下游細(xì)胞因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［2］。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）與腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化有關(guān)［3］?，F(xiàn)已證實(shí)，持續(xù)葡萄糖作用可促使腎小球系膜細(xì)胞（MC）中TGF-β1表達(dá)升高，TGF-β1通過激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，導(dǎo)致GluT-1過表達(dá)，造成MC對葡萄糖攝取增加，最終導(dǎo)致纖連蛋白（FN）、Ⅳ型膠原等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分累積［4-5］。研究表明，氟伐他汀干預(yù)可抑制高糖引起的MC中GluT-1過表達(dá)、減少TGF-β1的合成，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)積聚，延緩DN進(jìn)展［6］。Maresin1是促炎癥消退介質(zhì)中的一種［7-8］，有著強(qiáng)大的抗炎效果［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，Maresin1可通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少FN的合成與表達(dá)，從而延緩肺纖維化進(jìn)展［11］。2021年8月—2022年3月，本研究觀察了Maresin1對高糖環(huán)境下小鼠MC纖維化的干預(yù)作用，探索Maresin1能否通過抑制腎小球系膜細(xì)胞早期纖維化而延緩小鼠DN進(jìn)展。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料小鼠腎小球系膜細(xì)胞株（中國科學(xué)院），Maresin1（美國Cayman Chemical公司），TGF-β1、GluT-1、β-actin引物（上海生工生物工程有限公司），瓊脂糖（西班牙Biowest公司），胎牛血清（澳大利亞Bovogen公司）；小鼠FN、Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒（北京誠林生物科技有限公司），總RNA提取試劑盒（北京天根生化公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒（日本Toyobo公司），低糖DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）。

1.2 細(xì)胞分組與干預(yù)方法體外培養(yǎng)小鼠MC，將細(xì)胞分為NC組、OP組、HG組、M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組、M2+NC組。NC組、OP組、M2+NC組培養(yǎng)于含5.6 mmol/L葡萄糖及10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，OP組在培養(yǎng)基中加入24.4 mmol/L的甘露醇，M2+NC組以10 nmol/L的Maresin1預(yù)處理30 min。HG組、M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組培養(yǎng)于含30 mmol/L葡萄糖及10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組分別給予1、10、100 nmol/L的Maresin1預(yù)處理30 min［12］。各組均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，高糖環(huán)境下，MC中TGF-β1、GluT-1 mRNA及FN、Ⅳ型膠原表達(dá)于培養(yǎng)48 h達(dá)峰值，培養(yǎng)72 h仍保持高表達(dá)，故選擇培養(yǎng)48 h后、待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3 細(xì)胞中TGF-β1、GluT-1 mRNA檢測采用RTPCR法。取各組細(xì)胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別擴(kuò)增產(chǎn)物。TGF-β1基因上游引物序列為5'-AGACAGCCACTCAGGCGTAT-3'，下游引物序列為5'-CTGTCCAAACTAAGGCTCGC-3'；GluT-1基 因上游引物序列為5'-AGATGATGCGGGAGAAGAAG-3'，下游引物序列為5'-CACACAGTTGCTCCACATATTG-3'；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5'-ACCTCTATGCCAACACAGTG-3'，下游引物序列為5'-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3'。TGF-β1、GluT-1、β-actin降火溫度分別為59.8、54.0、54.0℃，熱循環(huán)30次，具體步驟參照文獻(xiàn)［13］。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝脂電泳，紫外燈下用凝膠成像系統(tǒng)成像。用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參灰度值的比值表示目的基因相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞上清液中FN、Ⅳ型膠原檢測收集各組上清液，采用ELISA法檢測FN、Ⅳ型膠原，具體步驟參照文獻(xiàn)［14］。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的光密度值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品光密度值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HG組細(xì)胞中G1uT-1、TGF-β1mRNA表達(dá)及上清液FN、Ⅳ型膠原水平高于NC組、OP組、M2+NC組（P均＜0.05）；M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組細(xì)胞中G1uT-1、TGF-β1mRNA表達(dá)及上清液FN、Ⅳ型膠原水平低于HG組，且M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組呈遞減趨勢（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞TGF-β1、GluT-1 mRNA表達(dá)及上清液FN、Ⅳ型膠原水平比較（±s）

表1 各組細(xì)胞TGF-β1、GluT-1 mRNA表達(dá)及上清液FN、Ⅳ型膠原水平比較（±s）

注：與NC組相比，aP＜0.05；與OP組相比，bP＜0.05；與HG組相比，cP＜0.05；與M1+HG組相比，dP＜0.05；與M2+HG組相比，eP＜0.05。

組別NC組OP組HG組M1+HG組M2+HG組M3+HG組M2+NC組GluT-1 mRNA 0.376±0.035 0.380±0.008 0.686±0.017ab 0.501±0.021abc 0.405±0.045abcd 0.397±0.027abcde 0.371±0.021cd TGF-β1 mRNA 0.737±0.035 0.767±0.014 1.355±0.018ab 1.228±0.013abc 0.930±0.066abcd 0.876±0.018abcde 0.687±0.007cd FN 0.345±0.008 0.352±0.010 0.616±0.010ab 0.598±0.004abc 0.412±0.002abcd 0.398±0.002abcde 0.329±0.001cdⅣ型膠原1.245±0.071 1.262±0.011 1.907±0.019ab 1.713±0.104abc 1.478±0.051abcd 1.451±0.034abcde 1.289±0.001cd

3 討論

持續(xù)高血糖作用可引起腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)堆積、成纖維細(xì)胞和腎小球纖維蛋白合成增加、腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致DN的發(fā)生［15］。DN有效治療措施較少，最終只能以腎移植和透析治療維持患者生命［16］，如何有效延緩或抑制DN的發(fā)生發(fā)展是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。腎組織纖維化是DN重要的病理生理基礎(chǔ)，若能拮抗腎早期纖維化則可明顯延緩腎臟損傷的進(jìn)程［17］。

GluT負(fù)責(zé)將葡萄糖由細(xì)胞外擴(kuò)散至細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞新陳代謝起著重要作用。研究表明，腎臟組織內(nèi)分布GluT-1～5，MC及其基質(zhì)內(nèi)的GluT主要以GluT-1為主，GluT-1可調(diào)節(jié)MC葡萄糖濃度，并進(jìn)一步激活下游的細(xì)胞因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與DN的進(jìn)展［18］。研究發(fā)現(xiàn)，DN患者腎小球GluT-1表達(dá)明顯增高，部分血糖控制良好的患者也有GluT-1過表達(dá)［19］。有學(xué)者將過表達(dá)GluT-1載體轉(zhuǎn)染血糖正常的小鼠，小鼠最終進(jìn)展為DN，提示在DN的發(fā)生發(fā)展中，GluT-1可能還存在獨(dú)立于高血糖之外的致病作用［20］。TGF-β1在MC合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞外持續(xù)性高糖刺激可作為促纖維化因素作用于MC，促進(jìn)TGF-β1的合成與分泌；TGF-β1過表達(dá)能通過激活蛋白激酶等細(xì)胞信號通路因子和多種細(xì)胞因子促使細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致糖尿病腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展［21-22］。研究發(fā)現(xiàn)，在DN的病程中，GluT-1和TGF-β1可相互作用，形成惡性循環(huán)：持續(xù)的高糖作用促使TGF-β1表達(dá)增加，而升高的TGF-β1可通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路誘導(dǎo)GluT-1過表達(dá)［23］，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞葡萄糖攝取增加和利用方式改變，進(jìn)而通過蛋白激酶C及多元醇通路促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)及活化［24］，導(dǎo)致系膜基質(zhì)大量代謝產(chǎn)物如FN、Ⅳ型膠原等沉積，最終導(dǎo)致DN惡化。本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖作用下小鼠MC中TGF-β1、GluT-1 mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，并于48 h達(dá)峰值，同時(shí)細(xì)胞上清液中FN、Ⅳ型膠原水平均升高。但TGF-β1與GluT-1相互作用具體機(jī)制及相關(guān)信號通路仍需進(jìn)一步探索。

既往研究表明，阻斷TGF-β1/Smad信號通路或應(yīng)用內(nèi)源性抗纖維化蛋白可減輕腎纖維化［25］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，使用TGF-β1中和抗體和TGF-β1信號抑制劑可有效降低FN水平，干預(yù)腎纖維化［26］。但介于多種細(xì)胞因子對GluT-1具有調(diào)節(jié)作用，單純使用TGF-β1阻斷劑不能最終影響GluT-1的表達(dá)。李英等［6］研究發(fā)現(xiàn)，氟伐他汀干預(yù)可減少高糖刺激下MC中TGF-β1的合成及GluT-1表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)FN及Ⅳ型膠原積聚，延緩DN進(jìn)展。LUO等［27］發(fā)現(xiàn)，芡實(shí)可能通過下調(diào)腎組織中GluT-1及TGF-β1表達(dá)，從而延緩DN進(jìn)展。

Maresin1是促炎癥消退介質(zhì)之一，具有強(qiáng)大的抗炎活性［7-8］。大量研究顯示，Maresin1在各種急慢性炎癥中表現(xiàn)出抗炎作用［28-29］。有研究發(fā)現(xiàn)，Maresin1還可通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，恢復(fù)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)，抑制FN和平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)，從而延緩肺纖維化進(jìn)展［11］。有學(xué)者以二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，使用Maresin1干預(yù)后，大鼠AST、ALT水平趨于正常，肝臟結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，炎癥減輕，肝臟壞死區(qū)域減?。籑aresin1治療后，促纖維化因子TGF-β1及其受體表達(dá)降低，類胰島素生長因子表達(dá)正?；?。這說明Maresin1有作為抗肝纖維化藥物的可能性［30］。在小鼠慢性胰腺炎模型中，Maresin1干預(yù)后胰腺損傷和纖維化明顯減輕［31］。但對于Maresin1能否通過抑制腎纖維化而干預(yù)DN進(jìn)展，目前尚不清楚。

本研究以不同濃度Maresin1干預(yù)高糖刺激的MC，結(jié)果顯示，MC中GluT-1、TGF-β1mRNA表達(dá)和FN、Ⅳ型膠原分泌明顯受抑制，且與Maresin1濃度呈正相關(guān)，中劑量組即10 nmol/L的Maresin1作用明顯。而低糖培養(yǎng)的細(xì)胞使用Maresin1預(yù)處理后，纖維化指標(biāo)無明顯變化，提示Maresin1可能通過減少高糖狀態(tài)下MC中TGF-β1及GluT-1表達(dá)，抑制FN、Ⅳ型膠原累積，從而減輕腎纖維化。但Maresin1通過何種信號通路作用于TGF-β1及GluT-1尚不清楚，需要進(jìn)一步研究加以明確。

綜上所述，Maresin1可能具有抑制腎纖維化、延緩DN發(fā)生發(fā)展的作用，其機(jī)制可能與抑制高糖刺激下MC中TGF-β1、GluT-1過表達(dá)及減少FN、Ⅳ型膠原生成有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)為Maresin1治療DN的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。