黃芪治療腎透明細(xì)胞癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

趙凱，張宗亮，尹心寶，王振林，朱冠群，王科

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，沈陽 116600；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科

在泌尿系統(tǒng)性腫瘤中，腎細(xì)胞癌（RCC）病死率居首位［1］。RCC中，以腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）最常見，其發(fā)病相對隱匿，臨床表現(xiàn)無特異性，多數(shù)患者有明顯癥狀時已屬晚期。約20%的局限性腎癌患者手術(shù)治療后會發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。腎癌相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)已成為需要重視的公共衛(wèi)生問題［2］。黃芪作為常用的補(bǔ)益類中藥，有益氣固表、補(bǔ)氣升陽、托膿透毒的功效［3］。黃芪的有效成分黃芪多苷被證實具有抗腫瘤作用，黃芪精口服液、黃芪注射液等黃芪制品已用于臨床抗腫瘤治療，但具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選黃芪治療ccRCC的活性成分及作用靶點，初步分析黃芪治療ccRCC的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 黃芪活性成分和靶基因的篩選在TCMSP平臺檢索黃芪活性成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。在TCMSP平臺分析黃芪活性成分所對應(yīng)的相關(guān)靶點，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 ccRCC疾病靶點篩選以“clear-cell renal cell carcinoma”“ccRCC”為關(guān)鍵詞，分別在Genecards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank五個數(shù)據(jù)庫中檢索ccRCC相關(guān)基因，并對各數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果進(jìn)行合并，建立ccRCC相關(guān)基因。從GEO NCBI數(shù)據(jù)庫下載ccRCC相關(guān)芯片。芯片納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象包含ccRCC患者和正常對照；②研究類型為Expression profiling by array；③篩選有關(guān)人類ccRCC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)GSE168845的芯片數(shù)據(jù)符合要求，包含4個ccRCC樣本和配對對照樣本。下載芯片中的矩陣文件和GPL21185平臺文件。應(yīng)用Strawberry Perl5.30.2.1軟件將基因探針注釋為基因名稱。用R語言“l(fā)ima”包進(jìn)行差異分析，以|log-FC|＞1且校正P＜0.05篩選差異表達(dá)基因，并用“pheatmap”包繪制火山圖，選取表達(dá)上調(diào)和下調(diào)最顯著的前20個基因繪制熱圖。使用Venn將數(shù)據(jù)庫檢索到的疾病基因與GEO數(shù)據(jù)庫獲得的差異基因去重復(fù)值，作為ccRCC的疾病靶點。

1.3 黃芪治療ccRCC的核心活性成分及靶點篩選將“1.1”獲得的藥物靶點和“1.2”得到的疾病靶點取交集，定義為黃芪治療ccRCC的關(guān)鍵靶點并生成Venn圖。利用Cytoscape3.8.0軟件得到藥物—成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖由表示藥物、化合物、靶點和疾病的節(jié)點和表示相互作用的邊所構(gòu)成。節(jié)點的自由度和介數(shù)越大，表明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要，篩選得到核心成分。將藥物與疾病的交集靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型。將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，將置信度設(shè)置為“combine score＞0.900”，排除網(wǎng)絡(luò)中游離的部分節(jié)點，獲取黃芪治療ccRCC的PPI網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape中的CytoNCA插件構(gòu)建關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)。

1.4 黃芪治療ccRCC靶基因功能分析借助R語言和Bioconductor生物信息軟件包中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”“DOSE”“pathview”，并設(shè)置過濾條件為P≤0.05，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以柱狀圖或氣泡圖的結(jié)果呈現(xiàn)。

1.5 活性成分與靶點蛋白的分子對接驗證將PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的核心靶點和藥物—成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)中篩選出的主要活性成分進(jìn)行分子對接。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中搜索所選基因編碼的受體蛋白，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白的3D PDB格式結(jié)構(gòu)，在Pub Chem數(shù)據(jù)庫下載分子配體的二維結(jié)構(gòu)，利用ChemBio 3D軟件計算和導(dǎo)出3D結(jié)構(gòu)；再用PyMOL2.4.0軟件處理受體蛋白，用Auto Dock Tools1.5.6軟件處理后，保存為pdbqt格式文件；用Auto Dock Tools及Auto Dock Vina軟件進(jìn)行分子對接，采用PyMOL軟件進(jìn)行可視化處理。對接分?jǐn)?shù)越低表明靶點蛋白與化合物的結(jié)合力越強(qiáng)。將最佳化合物—靶點對放入PyMOL軟件中進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性成分及治療靶點以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件，得到有效成分21個。在TCMSP平臺的DrugBank數(shù)據(jù)庫共得到462個潛在治療靶點，去重及標(biāo)準(zhǔn)化后得到395個潛在治療靶點。

2.2 黃芪治療ccRCC的靶點搜集到ccRCC疾病靶點9 552個，篩選出ccRCC差異表達(dá)基因2 946個。將2 946個差異表達(dá)基因與疾病靶點基因用Venn去重，共獲得ccRCC疾病靶 點10 898個。將ccRCC疾病靶點與黃芪活性成分治療靶點進(jìn)行交集，最終獲得180個藥物—疾病交集靶點，即黃芪治療ccRCC的靶點。

2.3 黃芪治療ccRCC的核心成分對數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到一個包含196個節(jié)點和2 979條邊的網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得出度值排名前5位的活性成分分別為槲皮素（134）、山柰酚（53）、黃芪皂苷（34）、芒柄花素（30）、異鼠李素（28），這些度值較高的活性成分可能是黃芪治療ccRCC的核心成分。

2.4 黃芪治療ccRCC的核心靶點黃芪治療ccRCC的PPI網(wǎng)絡(luò)中包括179個節(jié)點、586條邊，平均節(jié)點度值為6.55。根據(jù)其度值，使用CytoNca軟件，獲得了由13個靶基因組成的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活化因子（JUN）、腫瘤蛋白P53（TP53）、蘇氨酸激酶1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等蛋白相互作用頻次高，靶點與靶點之間相互作用強(qiáng)，可能為黃芪治療ccRCC的核心靶點。

2.5 黃芪治療ccRCC靶點基因的GO富集分析結(jié)果黃芪治療ccRCC靶點基因的GO分析結(jié)果共涉及2 529個條目，其中生物過程（BP）2 250條、分子功能（MF）203條、細(xì)胞成分（CC）76條。富集程度前10的條目見表1。黃芪治療ccRCC的靶點基因主要涉及細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞缺氧反應(yīng)的正調(diào)控等。此外，還有20個與免疫相關(guān)的GO富集，提示靶基因在惡性腫瘤中起重要作用。

表1 黃芪治療ccRCC靶點基因的GO富集分析結(jié)果

2.6 黃芪治療ccRCC靶點基因的KEGG富集分析結(jié)果黃芪治療ccRCC靶點基因的KEGG富集分析結(jié)果共涉及175條通路，P值排序前30的通路見表2。靶點基因主要富集于PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、Th17細(xì)胞分化等。

表2 黃芪治療ccRCC靶點基因的KEGG分析結(jié)果

2.7 黃芪核心活性成分與核心靶點結(jié)合能力預(yù)測結(jié)果將黃芪核心活性成分槲皮素、山柰酚、黃芪皂苷、芒柄花素、異鼠李素與核心靶點JUN、TP53、AKT1、MAPK14進(jìn)行分子對接結(jié)合能力預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪的5種活性成分與4個關(guān)鍵靶點均有較強(qiáng)的結(jié)合能力（結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol），其中槲皮素-8.4 kcal/mol、山 柰 酚-8.1 kcal/mol、黃 芪 皂苷-8.7 kcal/mol、芒柄花素-7.7 kcal/mol、異鼠李素-7.4 kcal/mol。

3 討論

黃芪的入藥部位為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，其化學(xué)成分主要分為三大類，分別為多糖類、皂苷類和黃酮類。黃芪在抗腫瘤治療方面具有著積極作用［4］，但抗腫瘤的具體作用機(jī)制尚不完全明確。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接等方法系統(tǒng)探討黃芪治療ccRCC的潛在活性成分、作用靶點及信號通路，共篩選出5個核心活性成分，其中槲皮素、山柰酚、芒柄花素、異鼠李素均屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物泛指兩個苯環(huán)通過三個碳原子相互連接而成的一系列化合物，其廣泛存在于植物中，屬植物次生代謝產(chǎn)物，可調(diào)節(jié)與惡性腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程，包括炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等［5］。

WEI等［6］發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過抑制PD-1/PD-L1相互作用來減弱PD-L1對T細(xì)胞的抑制作用，使腫瘤生長速率降低。槲皮素被認(rèn)為對輻射引起的肝腎損傷具有治療潛力。在體內(nèi)惡性腫瘤模型中，槲皮素對順鉑腎毒性的干預(yù)作用與其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用有關(guān)，而且這些特性并不影響順鉑的抗腫瘤效果［7］。山柰酚為一種主要來源于姜科草本植物山柰根莖的黃酮類化合物。實驗研究顯示，山柰酚能通過多途徑、多靶點抑制惡性腫瘤的生長［8］。芒柄花素又名刺芒柄花黃素、芒柄花黃，是一種植物異黃酮，具有明顯的植物雌激素特點。研究表明，芒柄花素通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯及抑制細(xì)胞的遷移、侵襲等發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。異鼠李素是槲皮素的直接代謝物，其能抑制多種類型惡性腫瘤，包括宮頸癌、胃癌、皮膚癌、結(jié)腸癌、肺癌等［10-11］。黃芪皂苷是一種主要來源于中藥黃芪的皂苷類物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤及增效減毒的作用［12］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷能夠顯著激活CD45蛋白酪氨酸磷酸酯酶，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能［13］。王敏等［14］通過體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷可顯著抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移。但黃芪皂苷對ccRCC治療作用的文獻(xiàn)報道較少，值得后期進(jìn)一步探究。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)模型篩選得到度值最高的13個核心靶點，包括AKT1、JUN、TP53、MAPK14等，其中AKT1可能是黃芪治療ccRCC的關(guān)鍵靶點［15-16］。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，有AKT1、AKT2、AKT3三種亞型，均由3個功能域組成。AKT的激活促進(jìn)下游分子磷酸化，調(diào)控下游多種蛋白質(zhì)如mTOR、Bad、Caspase-9、NF-κB、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞家族等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、凋亡及血管生成等［17-18］。JUN是AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子的成員之一，通過與靶基因啟動子中的TRE元件結(jié)合，活化下游核轉(zhuǎn)錄因子激活轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞改變。OYA等［19］發(fā)現(xiàn)，c-JUN高表達(dá)與獲得性囊性腎臟疾病和腎細(xì)胞癌非典型細(xì)胞異常增殖有關(guān)，強(qiáng)調(diào)了c-JUN活化在腎細(xì)胞癌早期病變過程中的作用。TP53基因編碼具有轉(zhuǎn)錄激活、DNA結(jié)合和寡聚化域的腫瘤抑制蛋白，是抑癌基因，能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老，TP53基因突變與多種人類惡性腫瘤有關(guān)。研究顯示，存在TP53基因突變的轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌進(jìn)展更快［20］。作為P38 MAPK家族的重要成員，MAPK14在多種惡性腫瘤中發(fā)揮雙重作用。有報道稱，PTEN可以降低MAPK14的活性，抑制腎癌細(xì)胞的增殖與遷移［21］。

GO基因富集分析結(jié)果顯示，黃芪治療ccRCC的靶點基因涉及多個生物學(xué)過程，包括細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞缺氧反應(yīng)，對藥物、損傷、細(xì)胞外刺激的反應(yīng)，氧水平的調(diào)控，活性氧代謝過程，細(xì)胞轉(zhuǎn)移酶活性以及細(xì)胞凋亡、增殖調(diào)控等。KEGG通路富集結(jié)果顯示，黃芪治療ccRCC的靶點基因主要富集在PI3K-AKT、MAPK、AGE-RAGE、TNF、IL-17等信號通路。其中PI3K/AKT信號通路基因富集數(shù)目最多、顯著性最明顯，提示PI3K/AKT信號通路可能起著重要作用。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成的二聚體，其與生長因子受體結(jié)合后，可改變AKT蛋白結(jié)構(gòu)并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游底物（如凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-9）活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及遷移等過程。PI3K/AKT通路的下游靶點哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用。mTOR的下游轉(zhuǎn)錄因子包括HIF-1α、c-Myc、FoxO等［22］，與ccRCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。MAPK信號通路是真核生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中較為重要的途徑，不僅能夠在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，還參與腫瘤耐藥的發(fā)生［23］。有研究報道，阻斷一個或多個MAPK信號通路可抑制腎癌的進(jìn)展［24］。AGEs-RAGE系統(tǒng)與多種疾病有關(guān)，包括糖尿病的血管并發(fā)癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥、自身免疫性疾病及腫瘤等。AGE-RAGE信號通路可通過影響氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與自噬等參與惡性腫瘤的發(fā)病［25］。TNF-α信號通路在器官發(fā)育、免疫反應(yīng)和造血等多種生理過程中發(fā)揮作用，也與腫瘤等許多疾病的發(fā)生有關(guān)。GWU等［20］的研究表明，腎癌患者血清TNF-α表達(dá)水平明顯低于健康志愿者，且TNF-α表達(dá)水平與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)。本研究中，黃芪的核心活性成分與核心靶點之間具有良好的結(jié)合活性，這也印證了黃芪治療ccRCC的科學(xué)性。同時我們發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷對核心靶點的結(jié)合活性很強(qiáng)，其對ccRCC的治療作用值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出黃芪治療ccRCC的主要活性成分，這些活性成分可能通過關(guān)鍵靶點AKT1，參與PI3K-AKT等信號通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能及影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等作用，從而治療ccRCC。本研究初步闡明了黃芪治療ccRCC的主要活性成分及可能的作用靶點和相關(guān)通路，為后續(xù)研究提供了思路。