原發(fā)性青光眼生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展△

王 玲 樊 芳 賈志旸

青光眼是多種因素綜合作用導(dǎo)致的一種視神經(jīng)退行性疾病，是全世界公認(rèn)的危害性極強(qiáng)的致盲性眼病，預(yù)計(jì)到2040年，全球患病人群將超過1億人次[1]。房水的生成主要依靠睫狀突的主動(dòng)分泌，引流路徑主要包括了小梁網(wǎng)(TM)/Schlemm管途徑和葡萄膜-鞏膜途徑[2]。房水的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持眼壓的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，眼壓升高被認(rèn)為是青光眼最主要的危險(xiǎn)因素。眼內(nèi)組織的代謝及免疫情況可通過房水中細(xì)胞因子的變化來反映，在某些特定疾病中能夠發(fā)揮出重要的診斷及治療價(jià)值。眾多研究證實(shí)，在青光眼患者房水中多種細(xì)胞因子表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，如炎癥因子、自身免疫相關(guān)因子、氧化還原相關(guān)因子和缺血缺氧相關(guān)因子等。生物標(biāo)志物作為一種生物信號(hào)，需要同時(shí)具備特異性、靈敏性、有效性和可重復(fù)性等特征[3]。目前尚無確切的目標(biāo)分子用于青光眼高危人群的篩查、早期特異性診斷、嚴(yán)重程度分級(jí)、進(jìn)展監(jiān)測及術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等，因此，迫切需要篩選出合適的生物標(biāo)志物。近年來，隨著高通量檢測技術(shù)的快速發(fā)展，單次使用微量標(biāo)本便可以同時(shí)定量檢測出多種細(xì)胞因子，涌現(xiàn)了眾多關(guān)于各類蛋白質(zhì)、代謝物和基因的相關(guān)研究，同時(shí)出現(xiàn)了大量可供選擇的潛在相關(guān)標(biāo)志物，為青光眼的進(jìn)一步研究提供了有力證據(jù)。

1 原發(fā)性青光眼候選生物標(biāo)志物

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)生物標(biāo)志物隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，眼部疾病差異蛋白的篩選更加簡便且精準(zhǔn)。近年來，青光眼蛋白質(zhì)組學(xué)研究也取得了巨大進(jìn)展。房水蛋白質(zhì)的改變與青光眼進(jìn)展階段密切相關(guān)，多項(xiàng)研究分析了青光眼患者房水的蛋白質(zhì)組成[4-5]。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析技術(shù)，在原發(fā)性開角型青光眼(POAG)患者房水中進(jìn)行了非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)研究,結(jié)果鑒定出863種不同的蛋白質(zhì)，其中136種存在差異，上調(diào)蛋白質(zhì)與急性炎癥反應(yīng)相關(guān)，下調(diào)蛋白質(zhì)主要與免疫應(yīng)答、補(bǔ)體激活等相關(guān)[6]。Adav等[7]首次全面分析了原發(fā)性閉角型青光眼(PACG)和白內(nèi)障患者房水中的蛋白質(zhì)組，共檢測出1363種不同的蛋白質(zhì)。在PACG患者中多種蛋白質(zhì)差異表達(dá)，大部分蛋白質(zhì)富含非典型的膠原蛋白和纖連蛋白，表明小梁基質(zhì)的組成發(fā)生了顯著變化。Kaur等[8]在POAG、PACG和白內(nèi)障患者的房水中檢測出246種蛋白質(zhì)存在顯著差異，青光眼患者房水中參與組織血管重塑和免疫應(yīng)答途徑的主要蛋白質(zhì)比例均上調(diào)。急性閉角型青光眼(AACG)患者房水中檢測出91種差異蛋白，其中炎癥相關(guān)因子表達(dá)顯著增加[9]。上述研究均顯示青光眼患者房水中蛋白質(zhì)表達(dá)存在顯著差異，主要與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答、補(bǔ)體激活等途徑相關(guān)，產(chǎn)生的原因以及所造成的后果還未完全闡明?？焖偕叩难蹓?、前房的急性炎癥、TM損傷、缺血缺氧和血-房水屏障受損等因素之間相互作用的機(jī)制還需要展開進(jìn)一步的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)蛋白質(zhì)整體的研究，使尋找房水中蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的定量差異成為可能，可為青光眼病原學(xué)應(yīng)答機(jī)制的研究提供關(guān)鍵信息。

大量研究表明，原發(fā)性青光眼患者房水中多種細(xì)胞因子表達(dá)顯著增加，其中最重要的有白細(xì)胞介素(IL)家族成員、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等各類炎癥相關(guān)細(xì)胞因子。IL-8可將炎癥及免疫細(xì)胞吸引到受損部位參與炎癥反應(yīng)，具有免疫激活和血管功能[10]。在缺氧的情況下，可刺激IL-8的分泌增加。研究證實(shí)，IL-8在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織中產(chǎn)生，在房水中易于檢出。IL家族成員在纖維化過程中起中心作用。多項(xiàng)研究表明[11-12]，青光眼患者房水中IL-6、IL-8水平明顯升高，且IL-8濃度差異最明顯，似乎是多因素綜合作用的結(jié)果；各種研究結(jié)果一致表明，IL-8參與了青光眼的發(fā)病機(jī)制，房水中IL-8的高表達(dá)可作為青光眼發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素；同時(shí)IL-8水平可用于青光眼的監(jiān)測和管理，并作為改善青光眼患者手術(shù)預(yù)后的治療靶標(biāo)。IL-36在上皮細(xì)胞和特異性免疫細(xì)胞中表達(dá)水平提高，并可誘導(dǎo)細(xì)胞活化。在關(guān)于急性葡萄膜炎患者的房水研究中發(fā)現(xiàn)IL-36濃度明顯增加，并且發(fā)現(xiàn)其與自身免疫反應(yīng)有關(guān)，表明IL-36不僅參與炎癥反應(yīng)，還參與了宿主對(duì)抗病原體入侵的免疫過程[13]。已經(jīng)在炎癥性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡)中觀察到抗炎細(xì)胞因子IL-37的表達(dá)顯著增加，證實(shí)了IL-37可能在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的過程中發(fā)揮重要作用；IL-38通過發(fā)揮抗炎作用參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)；近期在PACG患者房水中檢測出新型細(xì)胞因子IL-36、IL-37、IL-38濃度增加[13-14]，為炎癥反應(yīng)在青光眼中的作用提供了更多證據(jù)，目前關(guān)于房水炎癥因子的研究還在繼續(xù)擴(kuò)展。

在多項(xiàng)關(guān)于原發(fā)性青光眼患者房水的研究中發(fā)現(xiàn)，MCP-1、VEGF、TGF-β等纖維化密切關(guān)聯(lián)的多種細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著增加，MCP-1已被證明具有促纖維化的作用[14-15]，在青光眼患者房水中表達(dá)水平升高[16-17]，且與術(shù)后早期瘢痕形成具有一定的相關(guān)性，是影響青光眼濾過性手術(shù)(GFS)預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素，MCP-2、MCP-3似乎也參與了青光眼的發(fā)生發(fā)展。VEGF對(duì)血管具有多種功能，在新生血管的形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。同時(shí)大量研究表明，VEGF參與了各種組織的纖維化過程，并且與術(shù)后組織愈合密切相關(guān)。在新生血管性青光眼、假性剝脫性青光眼、PACG、POAG患者的房水中觀察到一致的表現(xiàn)，VEGF濃度顯著增加[18-20]。多項(xiàng)研究表明，原發(fā)性青光眼患者房水中VEGF的濃度增加，且與眼壓呈正相關(guān)[21]，表明血管因素在青光眼發(fā)病中起著重要作用。TGF-β在傷口愈合、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[22]，小梁網(wǎng)是其內(nèi)源性來源。作為眼內(nèi)最主要的亞型，TGF-β2可以改變TM的結(jié)構(gòu)[23-24]。Guo等[25]開展了針對(duì)不同類型青光眼患者的房水研究，結(jié)果顯示，TGF-β2和分泌性卷曲相關(guān)蛋白1的表達(dá)有所差異，AACG高眼壓患者較正常眼壓者房水濃度升高，且分泌性卷曲相關(guān)蛋白1的濃度和眼壓呈正相關(guān)。亞太地區(qū)AACG急性發(fā)作期房水中TGF-β1、TGF-β2濃度增加[26]，與眼部暫時(shí)性的缺血性損傷密切相關(guān)。研究表明，TM中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)作為重要因素參與了眼壓的調(diào)節(jié)，由于細(xì)胞因子TGF-β2參與了ECM的組成和TM肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，因此，研究與ECM相關(guān)的房水蛋白的表達(dá)可能發(fā)現(xiàn)與青光眼病理生理相關(guān)的重要潛在生物標(biāo)志物。上述細(xì)胞因子可作為臨床治療靶標(biāo)，若采用有效治療措施降低其濃度，可減輕眼部組織損傷，從而改善預(yù)后。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)屬于多結(jié)構(gòu)域鋅金屬蛋白酶，研究證實(shí)其能夠在ECM的降解及重塑、傷口愈合及組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[27-29]。被認(rèn)為可以和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)共同調(diào)控機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)[30]。MMPs與TIMPs的比值通常是11，在眼壓調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，比值的失衡可能影響組織重塑和傷口愈合的過程[31]。目前在人體組織中已發(fā)現(xiàn)23種MMPs，MMPs參與了各種類型青光眼的病理過程，特別是MMP-2和MMP-9作用顯著。研究發(fā)現(xiàn)，青光眼患者房水中MMP-2濃度顯著增加，并且TIMPs/ MMPs出現(xiàn)了比例的失衡[32]。研究證實(shí)，MMPs參與了POAG發(fā)病過程中的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，視神經(jīng)盤組織重塑及篩骨形狀改變等環(huán)節(jié)[33]。在亞太地區(qū)，AACG患者房水中MMP-2和TIMP-1水平顯著升高，MMP和TIMP比例失衡[34]。MMPs 、TIMPs的增加及比值的失衡可能會(huì)導(dǎo)致ECM的過度沉積或異常的ECM成分形成，使房水流出阻力增加，并且影響GFS的愈后。ECM的異常表現(xiàn)在青光眼發(fā)病過程及預(yù)后中占有重要地位，MMPs可作為青光眼TM損傷候選生物標(biāo)志物。采取降低眼壓聯(lián)合抗炎治療，可減少由于纖維化和炎癥改變引起的組織損傷。

氧化應(yīng)激主要表現(xiàn)為氧化和抗氧化兩者之間的不平衡，越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激作為青光眼的危險(xiǎn)因素之一，與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)變性密切相關(guān)[35]。Hondur等[36]發(fā)現(xiàn)，青光眼患者房水中蛋白質(zhì)羰基和高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物水平更高，且較血液差異更明顯。Tang等[37]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激相關(guān)生物標(biāo)志物超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶在青光眼房水及血液中表達(dá)水平顯著升高，這表明了在青光眼的發(fā)病過程中氧化應(yīng)激可能參與其中，并且扮演了重要角色。

與此同時(shí)，青光眼致病因素中除了炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)退行性改變外，免疫系統(tǒng)也參與其中[38]。在青光眼患者的血清、房水中檢測到自身抗體水平的改變，與其他神經(jīng)退行性疾病類似。其中熱休克蛋白抗體水平提高[39-40]，可能對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞造成直接損害，在青光眼中起關(guān)鍵作用[41]；神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白和γ-突觸核蛋白等具有神經(jīng)保護(hù)作用的抗體減少，減弱甚至可能失去自身保護(hù)作用；補(bǔ)體3a/補(bǔ)體3比值顯著增加，補(bǔ)體系統(tǒng)的失調(diào)在青光眼的進(jìn)展中發(fā)揮作用[42]。越來越多的研究證明，免疫相關(guān)成分在青光眼RGC喪失過程中起重要作用，發(fā)現(xiàn)多種具有診斷與治療潛力的自身免疫標(biāo)志物，可作為青光眼的治療靶標(biāo)。

1.2 代謝物組學(xué)相關(guān)生物標(biāo)志物定性和定量研究樣本中的小分子代謝產(chǎn)物被稱為代謝物組學(xué)研究，可以在尋找各類疾病的相關(guān)生物標(biāo)志物方面發(fā)揮積極作用，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)從房水中鑒定出250余種代謝物，主要包括氨基酸、碳水化合物、谷胱甘肽有機(jī)溶質(zhì)、腺苷、嘌呤、脂肪酸，?；鈮A等，它們屬于47種代謝途徑[43]。Buisset等[44]研究發(fā)現(xiàn)，POAG患者房水中?；撬岷途窛舛鹊鸵约?1種代謝物濃度高的代謝組學(xué)特征；POAG患者房水中代謝物組成較健康人存在顯著差異，主要表現(xiàn)為多種氨基酸、鄰氨基苯甲酸酯、抗壞血酸、4-羥基苯甲酸酯、肌醇、乙酸鹽、丙二醇、2-羥基丁酸酯和肌酸等的增加，L-苯丙氨酸、4-氨基丁酸、谷氨酰胺和異丙醇等的減少[45]。目前關(guān)于人房水的代謝組學(xué)研究較少，通過對(duì)房水代謝物組成的進(jìn)一步了解，有助于分析青光眼不同階段的作用機(jī)制，尋找合適的生物標(biāo)志物。

一氧化氮(NO)是帶中性電荷的無色氣體，屬于內(nèi)源性產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，具有抗氧化的作用。NO作為一種代謝產(chǎn)物，主要是在眼部組織中生成，參與合成3種一氧化氮合成酶的同工酶。在動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，NO對(duì)眼壓和房水動(dòng)力學(xué)具有直接影響，可通過直接作用于小梁網(wǎng)降低眼壓，從而作為重要的眼壓調(diào)節(jié)劑[46]。Muenster等[47]首次在動(dòng)物模型中研究證實(shí)，吸入NO可以增加房水的流出并且降低眼壓，NO對(duì)房水流出速率和眼壓的影響通過異二聚酶鳥苷酸環(huán)化酶a1b1-1介導(dǎo)，據(jù)此可將其作為青光眼的潛在治療靶點(diǎn)。

微量元素水平與某些眼部疾病密切相關(guān)，目前關(guān)于POAG患者房水中微量元素的研究一致發(fā)現(xiàn)鋅、鐵、汞濃度顯著升高[40-49]。β-內(nèi)啡肽可參與人體生理功能的調(diào)節(jié)，是內(nèi)源性產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，PACG急性發(fā)作期高眼壓狀態(tài)下患者房水中β-內(nèi)啡肽濃度較低，其可能參與了眼壓的調(diào)節(jié)，并且與青光眼的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[50]。需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證代謝物相關(guān)生物標(biāo)志物，可將其作為了解青光眼病因和病理生理的有力工具。

1.3 基因組學(xué)相關(guān)生物標(biāo)志物基因組學(xué)研究確定了幾種遺傳生物標(biāo)記。微小RNA(miRNA)屬于內(nèi)源性非編碼寡核糖核苷酸，可通過識(shí)別靶mRNA的特定序列發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[51]。各類研究已鑒定出百余種循環(huán)miRNA，為不同疾病提供了多樣的生物標(biāo)志物選擇，如各種心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥等[52-54]。miRNA在血漿和房水等樣本中含量豐富且穩(wěn)定[55]，應(yīng)用PCR技術(shù)深入研究結(jié)果顯示，與健康人群相比，POAG患者房水中多種miRNA差異表達(dá)[56-57]，Hindle等[58]提出，miR-637、miR-1306-5p和miR-3159的組合可區(qū)分出青光眼，為特定的miRNA作為青光眼潛在的生物標(biāo)志物提供了更多不同的選擇[59]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)主要參與調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[60]。Xie等[61]研究了POAG患者房水中l(wèi)ncRNA及mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，lncRNA T267384、ENST00000607393和T342877顯著升高，可能是診斷POAG的潛在生物標(biāo)志物，ENST00000607393可作為小梁網(wǎng)鈣化的治療新靶標(biāo)。非編碼RNA作為候選生物標(biāo)志物，在血漿、房水中的含量及種類易于檢測，為未來眼部疾病生物標(biāo)志物的發(fā)展提供了可靠選擇。青光眼的早期特異性檢測對(duì)于采取有效預(yù)防性治療至關(guān)重要，提供臨床上易于檢測的特異性生物標(biāo)志物將極大地提高疾病的早期診斷率。

2 原發(fā)性青光眼預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物

GFS屬于濾過性手術(shù)，是目前青光眼手術(shù)治療的最優(yōu)選擇，目的是為房水的引流創(chuàng)建一個(gè)有效的濾過通道。傷口的愈合過程通常會(huì)引起引流部位的纖維化和瘢痕化，從而導(dǎo)致房水流出阻力增加，觸發(fā)眼壓再次失控。眼壓作為重要危險(xiǎn)因素參與青光眼的病理過程，同時(shí)在臨床治療中被作為重要靶標(biāo)。青光眼的視神經(jīng)損害是無法逆轉(zhuǎn)或者避免的，目前唯一能夠有效延緩青光眼進(jìn)展的方法是采用各種手段降低眼壓。TM作為房水流出的主要部位，在青光眼治療中至關(guān)重要。最常使用的降低眼壓的手術(shù)方式是GFS。大量臨床研究顯示，房水中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)與GFS預(yù)后密切相關(guān)，目前研究發(fā)現(xiàn)，青光眼房水中IL-8、MCP-1濃度顯著升高且與GFS失敗率呈正相關(guān)，可用于評(píng)估手術(shù)預(yù)后[62]。IL-8、MCP-1是GFS治療失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，調(diào)控其表達(dá)對(duì)青光眼預(yù)后具有潛在價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，AACG患者房水中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1濃度顯著升高，多功能調(diào)節(jié)分子富含半胱氨酸酸性分泌蛋白表達(dá)增加，且后者與GFS治療失敗率呈正相關(guān)[63-64]，兩者均表現(xiàn)出作為GFS預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素特征。在POAG患者房水中觀察到內(nèi)皮素-1水平升高，且與眼壓之間存在顯著相關(guān)性[65]，是GFS后晚期低眼壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[66]。正是由于青光眼復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，相關(guān)作用路徑涉及眾多分子，選擇恰當(dāng)?shù)念A(yù)后標(biāo)志物存在困難。房水作為青光眼預(yù)后生物標(biāo)志物研究的主要來源，具有明顯優(yōu)勢(shì)。目前的研究主要涉及到炎癥過程和TM損傷過程，可作為改善青光眼手術(shù)預(yù)后的治療靶標(biāo)。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，目前大部分選擇房水進(jìn)行青光眼生物標(biāo)志物的相關(guān)研究，同時(shí)，在可選擇的眼部疾病研究樣本中房水具有明顯優(yōu)勢(shì)。各種高新檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和在臨床中的廣泛應(yīng)用，逐步揭示了青光眼房水組成及變化的多樣性。目前關(guān)于原發(fā)性青光眼生物標(biāo)志物的研究在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)、基因組學(xué)等方面不斷開展，從研究成果中發(fā)現(xiàn)并確立了大量可供選擇的候選生物標(biāo)志物。對(duì)青光眼的早期診斷、嚴(yán)重程度分層、評(píng)估手術(shù)預(yù)后及研究潛在的治療新藥物等具有重大意義，對(duì)更好地為患者選擇合適的個(gè)體化治療及預(yù)后干預(yù)措施提供新的方向和可靠依據(jù)。

青光眼作為導(dǎo)致全球不可逆性失明的最重要眼部疾病，以引起嚴(yán)重的視功能損害和視野喪失為主要特點(diǎn)。隨著人口老齡化的來臨，青光眼導(dǎo)致的嚴(yán)重視力障礙和失明將進(jìn)一步加重。若想在青光眼的早期階段就明確診斷，對(duì)臨床工作者而言是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)?；颊叱霈F(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀或者體征時(shí)，視力損害往往已經(jīng)發(fā)展到了比較嚴(yán)重的地步。目前大量研究人員在積極尋找參與青光眼病理生理過程的相關(guān)生物標(biāo)志物,研究樣本主要來源于患者的淚液、房水、血液和玻璃體。生物標(biāo)志物作為一種可測量的生物信號(hào)，可在機(jī)體的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)、代謝等作用過程中體現(xiàn)。目前關(guān)于青光眼生物標(biāo)志物的各種研究廣泛開展，旨在尋找合適的生物信號(hào)，以便能夠早期發(fā)現(xiàn)青光眼，以及對(duì)其進(jìn)行病情監(jiān)測和預(yù)估術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)等。由于青光眼復(fù)雜的病理生理過程，涉及多種分子作用途徑，從眾多的生物候選標(biāo)志物中選擇出最佳代表，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證研究。新的研究和探索還在不斷進(jìn)行，隨著青光眼相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展，相信不久的將來可以選擇出易于檢測、特異性高、靈敏度強(qiáng)的相關(guān)生物標(biāo)志物。