糞便標(biāo)志物在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎早期診斷中的研究進(jìn)展

宋淑婷，戴立英

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省兒童醫(yī)院新生兒科，合肥 230000)

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(neonatal necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒重癥監(jiān)護(hù)室常見(jiàn)的嚴(yán)重胃腸道急癥。我國(guó)一項(xiàng)多中心研究流行病學(xué)資料表明NEC發(fā)生率與體重呈負(fù)相關(guān)，在低出生體重兒(<2 500 g)中發(fā)病率約為 2.50%，在極低出生體重兒(<1 500 g)中發(fā)病率約為 4.53%[1]。目前NEC病死率仍高達(dá)20%～30%，并且存活的嬰兒可能存在長(zhǎng)期并發(fā)癥，如腸道狹窄或粘連、膽汁淤積、短腸綜合征和神經(jīng)發(fā)育遲緩等[2-3]，如果能早期甄別并及時(shí)治療，可降低病死率及預(yù)后不良發(fā)生率。目前主要依靠臨床表現(xiàn)、腹部X線以及血清指標(biāo)診斷，血液中降鈣素原、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、C反應(yīng)蛋白及半乳凝集素4等升高對(duì)預(yù)測(cè)NEC具有一定價(jià)值[4-5]，但需要采集患兒血液，為有創(chuàng)傷性操作，且主要反映全身炎癥情況，不能準(zhǔn)確提示腸道炎癥程度，特異性差。腹部X線提示門(mén)靜脈積氣或腸壁積氣時(shí)疾病往往已處于嚴(yán)重階段，不利于早期診斷和治療。所以亟須找到無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單、高敏感性和特異性的NEC標(biāo)志物。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)某些糞便標(biāo)志物[如鈣衛(wèi)蛋白、腸道菌群譜、自誘導(dǎo)分子2(autoinducer-2,AI-2)]在NEC發(fā)生發(fā)展中有一定的變化規(guī)律，提示可能成為早期診斷NEC的有效生物學(xué)指標(biāo)[6-8]?，F(xiàn)就糞便標(biāo)志物在NEC早期診斷中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 鈣衛(wèi)蛋白

1.1鈣衛(wèi)蛋白的生物學(xué)效應(yīng) S100蛋白家族是分子量約為36 000的鈣和鋅結(jié)合蛋白，由S100A8和S100A9組成二聚體，主要源于中性粒細(xì)胞，也在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)[9]。當(dāng)腸道出現(xiàn)炎癥時(shí)，鈣衛(wèi)蛋白在單核細(xì)胞、促炎因子及內(nèi)皮細(xì)胞的作用下被激活釋放，可作為急性炎癥細(xì)胞的活化產(chǎn)物。而且鈣衛(wèi)蛋白可與鈣、鋅等結(jié)合，不僅維持自身性質(zhì)的穩(wěn)定，防止被腸道蛋白酶水解，還能減少細(xì)菌生長(zhǎng)所需的原料，具有一定抗菌作用。鈣衛(wèi)蛋白存在于各種體液，在糞便中的濃度約為血液的6倍[10-11]。

1.2鈣衛(wèi)蛋白變化與NEC的關(guān)系 目前鈣衛(wèi)蛋白已用作炎性腸病診斷及疾病活動(dòng)度的檢查方法之一，但尚未作為一種特異性標(biāo)志物用于臨床NEC的診斷。有研究表明，NEC患兒糞鈣衛(wèi)蛋白含量較高，且NECⅠ、Ⅱ和Ⅲ期中鈣衛(wèi)蛋白含量也有明顯差別[12]。Qu等[6]的Meta分析結(jié)果顯示，糞鈣衛(wèi)蛋白診斷NEC的靈敏度和特異度分別為0.86和0.79。Meta分析結(jié)果顯示，鈣衛(wèi)蛋白診斷NEC的特異度和靈敏度分別為0.80、0.86[13]，表明糞鈣衛(wèi)蛋白可能是NEC的潛在生物標(biāo)志物。另有學(xué)者在鈣衛(wèi)蛋白診斷NEC的臨界值方面做了進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鈣衛(wèi)蛋白臨界值為226 pg/g，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.56[14]。同樣，一項(xiàng)研究通過(guò)分析國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室的5 144個(gè)糞鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)結(jié)果的NEC患兒數(shù)據(jù)，估算0～2個(gè)月大嬰兒鈣衛(wèi)蛋白的臨界值為247 pg/g，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.47[15]。綜上所述，鈣衛(wèi)蛋白在診斷NEC方面具有潛在價(jià)值，且能夠評(píng)估疾病嚴(yán)重程度。上述研究得出的臨界值差別不大，但陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均小于0.6，暫不建議臨床用于篩查NEC。因此，需要更多研究來(lái)明確鈣衛(wèi)蛋白在早期診斷NEC中的相應(yīng)臨界值，進(jìn)而輔助臨床診斷及評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度。

2 腸道菌群譜

2.1腸道菌群譜生物活性 腸道菌群譜是包括細(xì)菌、真菌、病毒等在內(nèi)的微生物集合，具有幫助食物消化，調(diào)節(jié)腸道免疫、代謝產(chǎn)物的合成，防御致病菌腸道內(nèi)定植等功能[16-17]。其主要通過(guò)腸道模式識(shí)別受體特異性識(shí)別微生物相關(guān)分子，并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，調(diào)節(jié)腸道屏障功能和抗菌肽的分泌來(lái)維持腸道穩(wěn)態(tài)，減少病原菌對(duì)腸道黏膜的黏附，調(diào)節(jié)免疫及預(yù)防感染，在保護(hù)腸道健康方面起重要作用。腸道菌群一旦失調(diào)即可導(dǎo)致腸道疾病(如腸易激綜合征、炎性腸病)[18-19]，還可能導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂(如糖尿病)[20]。

2.2腸道菌群譜變化與NEC的關(guān)系 NEC的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，因此NEC發(fā)生前、發(fā)生時(shí)及發(fā)生后的腸道菌群變化成為研究熱點(diǎn)。Pammi等[7]的Meta研究分析發(fā)現(xiàn)，在NEC發(fā)生前變形桿菌相對(duì)豐度上調(diào)，而厚壁菌門(mén)和擬桿菌的相對(duì)豐度降低。變形桿菌屬于革蘭陰性桿菌，其細(xì)胞壁主要成分是脂多糖，能識(shí)別腸上皮細(xì)胞Toll樣受體4，促進(jìn)促炎因子釋放，進(jìn)而引起腸道黏膜屏障損傷[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，NEC組的物種豐富度和Shannon多樣性指數(shù)降低，且大腸埃希菌、雙歧桿菌以及乳桿菌等有益菌含量顯著低于無(wú)胃腸道疾病的早產(chǎn)兒組，但NEC組中細(xì)菌和克雷伯菌的陽(yáng)性率較高[22]，表明NEC患兒中腸道菌群的多樣性降低，且有益菌減少。Fu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，NEC患兒克雷伯桿菌和Peptoclostridium豐度顯著高于有肺炎或高膽紅素血癥且無(wú)胃腸道疾病及癥狀的非NEC新生兒，單乳酸桿菌、巴斯德菌和副細(xì)菌的豐度顯著下降。

目前研究雖尚不能明確導(dǎo)致NEC的菌屬，但發(fā)生NEC前患兒腸道菌群已發(fā)生紊亂，因此菌群種類變化是未來(lái)的研究方向。

3 AI-2

3.1AI-2生物活性 群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌物種之間相互交流的重要途徑[24]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)AI-2是介導(dǎo)細(xì)菌之間交流的重要群體感應(yīng)信號(hào)分子，其由細(xì)菌LuxS基因編碼產(chǎn)生，來(lái)源于S-腺苷甲硫氨酸的代謝途徑，并廣泛存在于革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌。AI-2具有調(diào)節(jié)細(xì)菌表達(dá)及調(diào)控細(xì)菌毒力因子的作用，還能促進(jìn)細(xì)菌(如大腸埃希菌、乳酸桿菌)生物膜的形成[25-26]。一般細(xì)菌可通過(guò)形成生物膜來(lái)抵抗外界的不利環(huán)境，從而獲得持久的生物活性。

3.2AI-2變化與NEC的關(guān)系 AI-2作為一種標(biāo)志物在胃腸道領(lǐng)域已有較多研究，近年其開(kāi)始作為一種新型糞便標(biāo)志物進(jìn)入NEC研究領(lǐng)域。付春燕等[8]測(cè)定NEC急性期組(NEC診斷時(shí))、NEC恢復(fù)期組(NEC臨床癥狀好轉(zhuǎn)開(kāi)奶后3 d)、對(duì)照組(新生兒肺炎或高膽紅素血癥且無(wú)胃腸道疾病及癥狀的非NEC新生兒)糞便中AI-2水平，結(jié)果顯示，NEC急性期AI-2的水平顯著低于對(duì)照組，在恢復(fù)期顯著升高。該團(tuán)隊(duì)又進(jìn)一步以NEC動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)，同樣觀察到與上述臨床研究類似的AI-2變化規(guī)律[23]。當(dāng)引入高表達(dá)AI-2的細(xì)菌時(shí)，腸道紊亂和腸道菌群逐漸恢復(fù)。推測(cè)急性期由于腸道破壞導(dǎo)致AI-2下降，恢復(fù)期時(shí)AI-2迅速上升促進(jìn)損傷黏膜修復(fù)及腸道菌群正常，使臨床癥狀好轉(zhuǎn)。研究中還發(fā)現(xiàn)無(wú)抗生素組AI-2水平明顯高于對(duì)照組，表明使用抗生素可能會(huì)導(dǎo)致AI-2表達(dá)下降[8]。推測(cè)使用抗生素后腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)生變化，導(dǎo)致AI-2表達(dá)下降，但目前相關(guān)的確切證據(jù)不足。因此，AI-2在各個(gè)階段的變化可指導(dǎo)臨床早期診斷及推測(cè)NEC的發(fā)展進(jìn)程，在檢測(cè)病情方面具有重要意義。

4 揮發(fā)性有機(jī)物

4.1揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds,VOCs)生物活性 VOCs是細(xì)菌的代謝副產(chǎn)物，可通過(guò)汗液、呼出氣體、尿液、糞便等排出。其中糞便中散發(fā)的VOCs包括氫氣、甲烷、有機(jī)酸、雜環(huán)化合物、酮等，且能反映腸道微生物組成[27-28]。目前VOCs主要通過(guò)電子鼻鏡設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)，利用氣相色譜-質(zhì)譜定量及定性檢測(cè)樣品中存在的化合物[29]。VOCs變化或特異性改變可能反映個(gè)體的疾病狀態(tài)。

4.2VOCs變化與NEC的關(guān)系 近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)NEC發(fā)生時(shí)，VOCs發(fā)生相應(yīng)變化。Probert等[30]以1 326名早產(chǎn)兒(<34周)為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)NEC患兒糞便VOCs發(fā)生變化，且將VOCs歸為9類，其中4、5、8三類因子與NEC相關(guān)，因子4增加可導(dǎo)致NEC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高，因子5和8增加導(dǎo)致NEC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低，推測(cè)VOCs可能作為NEC診斷的早期生物標(biāo)志物。該研究精確到VOCs每一類因子的改變，而不只是模型上的改變，因此受到廣泛關(guān)注。此外，Hosfield等[27]以小鼠為研究模型，通過(guò)Cyranose?320 eNose裝置檢測(cè)出母乳與配方奶組糞便中VOCs無(wú)差異，但與NEC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即32個(gè)傳感器中有9個(gè)顯著不同，表明糞便中VOCs可能反映NEC的發(fā)生。

綜上所述，VOCs的變化與NEC具有一定相關(guān)性，但目前對(duì)VOCs的研究主要集中在炎性腸病以及鑒別炎性腸病與腸易激綜合征方面[31]，關(guān)于NEC的研究數(shù)據(jù)較少。

5 腸堿性磷酸酶

5.1腸堿性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase，IAP)生物活性 IAP是一種經(jīng)糖基磷脂酰肌醇鍵錨定于腸上皮細(xì)胞頂膜上的糖蛋白，由腸上皮細(xì)胞表達(dá)，可在腸腔、血液和糞便中檢測(cè)到。IAP可使脂多糖(革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，與其結(jié)合可促進(jìn)炎癥的發(fā)生)去磷酸化從而減少與腸細(xì)胞表面Toll樣受體4的結(jié)合，減少促炎因子的釋放，減輕腸道黏膜損傷[32]。IAP還可以調(diào)節(jié)腸道表面pH值和腸道中各種菌群的分布，保護(hù)腸道中各種共生菌群的生長(zhǎng)[33]。

5.2IAP變化與NEC的關(guān)系 當(dāng)敲除大鼠體內(nèi)IAP基因后，腸道菌群發(fā)生移位，且腸道黏膜通透性增加，利于機(jī)會(huì)病原體定植，導(dǎo)致腸道低度炎癥的發(fā)生[34]。有實(shí)驗(yàn)證明，有剖宮產(chǎn)和配方奶粉喂養(yǎng)等高危因素的NEC患兒IAP活性和轉(zhuǎn)錄顯著降低，且IAP活性峰值降低，但與生產(chǎn)方式無(wú)關(guān)[35]。Heath等[36]收集1 360名早產(chǎn)兒(胎齡<37周)糞便并檢測(cè)IAP水平和活性，也發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重NEC患兒糞便中IAP水平和活性降低，其陽(yáng)性率分別為0.97和0.76，高于以往其他已發(fā)現(xiàn)的NEC糞便標(biāo)志物。同時(shí)發(fā)現(xiàn)IAP水平及轉(zhuǎn)錄的降低與膿毒癥或其他非感染性胃腸道疾病無(wú)關(guān)，有望作為診斷NEC的糞便標(biāo)志物。

雖然以上研究表明在NEC發(fā)生時(shí)IAP的表達(dá)下降，且準(zhǔn)確性、特異性較高，但目前在NEC方面的相關(guān)研究相對(duì)較少，仍需要進(jìn)一步研究。

6 S100A2蛋白

6.1S100A2蛋白生物學(xué)活性 S100A2是S100家族成員之一，編碼基因與組成鈣衛(wèi)蛋白的二聚體S100A8/9的編碼基因位于同一條染色體，在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。S100A2可在巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)，主要由中性粒細(xì)胞分泌[37]。當(dāng)S100A12與鋅、鈣螯合后可識(shí)別細(xì)胞表面晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，通過(guò)核因子κB途徑上調(diào)IL-1β，同時(shí)也可成為T(mén)oll樣受體4的配體，促進(jìn)單核細(xì)胞激活促炎因子(如IL-6、IL-8)釋放，從而導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[38-39]。

6.2S100A12蛋白變化與NEC的關(guān)系 目前有研究提示糞S100A12蛋白與NEC的發(fā)生存在一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，極低體重(<1 000 g)NEC患兒糞S100A12水平與細(xì)菌總數(shù)及大腸埃希菌計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，但S100A12與乳桿菌、雙歧桿菌、脆弱芽孢桿菌無(wú)相關(guān)性[40]。D?britz等[41]研究發(fā)現(xiàn)，NEC早產(chǎn)兒糞S100A12水平高于非NEC早產(chǎn)兒，且NECⅢ期時(shí)S100A12中位數(shù)高于NECⅡ期(1 200 mg/kg比241 mg/kg)，同時(shí)估測(cè)出其診斷NEC的理想截?cái)嘀导s為65 mg/kg，靈敏度為0.76，特異度為0.56，而且有18例嬰兒在NEC臨床發(fā)作前1～2周S100A12升高。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，糞S100A12水平在NEC發(fā)生后顯著升高，但在NEC發(fā)生前未升高，可能提示疾病的進(jìn)展情況[42]。

綜上，推測(cè)S100A12升高可能是早期診斷NEC和預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度的潛在糞便標(biāo)志物。但有研究指出，健康嬰兒中也可能出現(xiàn)S100A12升高[43]，所以S100A12在NEC診斷上具有局限性，仍需更多研究探索S100A12與NEC發(fā)生的關(guān)系。

7 乳鐵蛋白

7.1乳鐵蛋白生物學(xué)活性 乳鐵蛋白是一種重要的非血紅素鐵結(jié)合蛋白，是中性粒細(xì)胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白。乳鐵蛋白可通過(guò)降低鐵的利用率抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)宿主對(duì)微生物的吞噬作用。因此，其不僅能夠防御有害微生物入侵，還能預(yù)防全身炎癥反應(yīng)[44]。乳鐵蛋白室溫下可在糞便中穩(wěn)定數(shù)天，冷藏條件下則可以持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。

總之，乳鐵蛋白含量檢測(cè)對(duì)NEC的早期診斷和嚴(yán)重程度具有一定的價(jià)值。但目前關(guān)于乳鐵蛋白的研究主要集中在成人炎性腸病[48]，乳鐵蛋白與NEC的研究較少，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

8 人β-防御素

8.1人β-防御素(human β-defensin，HBD)生物活性 HBD是一種抗菌肽，具有明顯的抗微生物作用，能夠有效地抵抗細(xì)菌、真菌及病毒等微生物的入侵，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)與宿主的適應(yīng)，是人類的第一道天然防線。HBD1由腸上皮細(xì)胞組成性表達(dá)，而HBD2主要是在機(jī)體發(fā)生感染或炎癥過(guò)程中被誘導(dǎo)性表達(dá)，其于1997年在銀屑病皮膚患者中首次發(fā)現(xiàn)[49]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生腸道炎癥時(shí)HBD2含量增加，HBD2含量與腸道菌群及大腸埃希菌計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，全身應(yīng)用HBD2可減輕腸道炎癥反應(yīng)[50-51]。HBD3可以顯著降低自噬激活蛋白的表達(dá)，下調(diào)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，并促進(jìn)腸道黏膜的完整性[52]。

8.2HBD變化與NEC的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)，生理情況下極早產(chǎn)兒生后糞便HBD1和HBD2含量開(kāi)始下降，2～4周維持在基線水平。在發(fā)生中度NEC時(shí)，糞便HBD2含量顯著增加，但是重度NEC在發(fā)病前后HBD2無(wú)明顯變化[53]。郭靜等[54]研究收集31例NEC早產(chǎn)兒和38例非NEC的早產(chǎn)兒入院當(dāng)日、確診后2 d及出科當(dāng)日的糞便，發(fā)現(xiàn)糞便HBD1和HBD2含量明顯低于同期住院的非NEC早產(chǎn)兒，表明HBD1和HBD2含量與NEC病情嚴(yán)重程度相關(guān)。

基于以上研究結(jié)果，HBD能否作為輔助NEC診斷和反映病情變化的生物標(biāo)志物有待進(jìn)一步研究。

9 小 結(jié)

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)NEC糞便標(biāo)志物的研究越來(lái)越多。目前研究較多的鈣衛(wèi)蛋白、腸道菌群譜及研究較少的AI-2、揮發(fā)性有機(jī)物等對(duì)NEC的早期診斷、病情評(píng)估及預(yù)后等有一定的敏感性和特異性，但均未估算出明確的截?cái)嘀?，且在診斷方面未達(dá)成一致觀點(diǎn)。相信隨著NEC病因及發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究及檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，將會(huì)發(fā)現(xiàn)一種或幾種理想的非侵入性糞便生物標(biāo)志物，以幫助早期診斷NEC及評(píng)估病情變化。