環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能及其在不同分子分型乳腺癌中的研究進(jìn)展

伊茹，蔡鳳林，符德元

(1.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044； 2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，江蘇 揚州 225001)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，沒有5′端7-甲基鳥苷三磷酸“帽子”和3′端多聚體“尾巴”的非編碼RNA。circRNA包括外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA和基因間circRNA四類[1]。circRNA由前體信使RNA(messenger RNA，mRNA)環(huán)化形成，多數(shù)存在于細(xì)胞質(zhì)，也有一些內(nèi)含子形成的circRNA存在于細(xì)胞核[2]。經(jīng)典RNA檢測方法通常只能識別RNA分子的多聚體“尾巴”結(jié)構(gòu)，故circRNA在既往研究中常被忽略[3]。circRNA最早于1976年在植物病毒中被發(fā)現(xiàn)，其具有特殊的形態(tài)學(xué)特征，對核酸外切酶的耐受性高，較親本線性RNA更穩(wěn)定[4]?，F(xiàn)已鑒定出真核生物中20 000多種circRNA，它可以存在于外泌體，并隨外泌體在體液(如血液、尿液、唾液)和母乳中循環(huán)[5]。由于其進(jìn)化保守性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及組織表達(dá)特異性，circRNA可能在腫瘤中作為特殊的分子標(biāo)志物發(fā)揮作用。

乳腺癌是女性中最常見的癌癥，也是全球癌癥死亡的主要原因，其分子特征及臨床表型具有高度異型性[6]。circRNA不僅參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，還可能是乳腺癌早期診斷、個體化預(yù)后評價的新型分子標(biāo)志物?，F(xiàn)對circRNA作用于不同分子分型乳腺癌的機制予以綜述，以期為尋求更有價值的乳腺癌應(yīng)對策略和更精確的靶向療法提供新思路。

1 circRNA的生物學(xué)功能

近年來，隨著大量circRNA的發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤和其他疾病相關(guān)的生物學(xué)功能逐漸顯現(xiàn)。circRNA可通過調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體激活等過程，從而影響人類疾病的發(fā)生。circRNA的生物學(xué)功能包括：通過circRNA-微RNA(microRNA，miRNA)-mRNA軸發(fā)揮海綿作用，翻譯蛋白質(zhì)；調(diào)控親本基因表達(dá)；與RNA結(jié)合蛋白相互作用等。

1.1海綿作用 circRNA作為競爭性內(nèi)源RNA發(fā)揮其特定功能。circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點，可通過miRNA應(yīng)答元件吸附miRNA，并負(fù)調(diào)控miRNA活性，因此被視為“miRNA海綿”[7]。ciRS-7(也稱為cDR1as)是第一個被定義為“miRNA海綿”的circRNA，ciRS-7包含70個以上miR-7保守結(jié)合位點，可在致癌基因和抑癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)中起作用，并可顯著抑制miR-7活性，促進(jìn)miR-7靶向致癌因子上調(diào)，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖[8-9]。多種circRNA在乳腺癌進(jìn)程(細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和耐藥性)中被激活，其中包括一些上調(diào)的circRNA，如hsa_circ_100876通過抑制miR-361-3p的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。circTADA2A-E6是由轉(zhuǎn)錄適配器2A經(jīng)反向剪接形成的circRNA，它可作為miR-203a-3p和miR-302c-3p的海綿，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[11]。circCER作為海綿抑制miR-136的活性，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移增加[12]。對阿霉素耐藥乳腺癌組織的研究證實，hsa_circ_0006528在阿霉素耐藥的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)[13]。下調(diào)的circRNA，如hsa_circ_000911通過使miR-449a海綿化正向調(diào)控跨膜受體蛋白Notch1表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]。hsa_circ_0072309通過調(diào)控miR-492增加G0/G1期階段的細(xì)胞數(shù)量，抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，抑制乳腺癌進(jìn)展[15]。circRNA還可通過miRNA海綿調(diào)節(jié)腫瘤的代謝，如circHIPK3通過調(diào)控miR-124抑制糖酵解中關(guān)鍵酶的表達(dá)[16]。circGFRA1通過調(diào)控miR-34a促進(jìn)三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)組織中的脂肪吞噬，完成脂質(zhì)利用[17]。circRNA的海綿作用可對應(yīng)一個或多個miRNA，現(xiàn)已證實hsa_circ_0001358可與5個miRNA(miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-376a-3p、miR-376b-3p和miR-429)結(jié)合[18]。circHIPK3共有18個潛在miRNA結(jié)合位點(每個miRNA有1～3個結(jié)合位點)，至少可以結(jié)合9種miRNA[19]。但僅少數(shù)circRNA顯示出miRNA海綿特性[20]。

1.2翻譯功能 有些circRNA具有翻譯功能。circRNA的翻譯無法通過依賴5′端7-甲基鳥苷三磷酸“帽子”的調(diào)控元件啟動，因此需要內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(internal ribosome entry site，IRES)或其他元件激活不依賴“帽子”結(jié)構(gòu)的途徑。有研究證實，一些circRNA具有通過IRES依賴性途徑和N6-甲基腺苷依賴性途徑編碼蛋白質(zhì)的能力[21]。circZNF609序列存在開放閱讀框和非翻譯區(qū)，且circZNF609的非翻譯區(qū)能夠作為IRES驅(qū)動IRES依賴性翻譯，證實circRNA具有編碼能力。circZNF609可作為miRNA海綿促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展，也可在肌生成過程中編碼蛋白[22]。SHPRH-146aa是circSHPRH產(chǎn)生的一種新蛋白質(zhì)，可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生[23]。由包含7的F-Box和WD重復(fù)域(F-Box and WD repeat domain containing 7，F(xiàn)BXW7)衍生的circRNA——circFBXW7是一種抑癌circRNA，circFBXW7可以編碼含有185個氨基酸的肽(FBXW7-185aa)，而FBXW7-185aa可通過誘導(dǎo)癌基因c-Myc的降解，抑制TNBC細(xì)胞的增殖和遷移[24]。上述circRNA編碼的肽通過干擾腫瘤的新陳代謝或轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗腫瘤作用[25]。circRNA雖然打破了傳統(tǒng)非編碼RNA的特性，但與線性對應(yīng)物相比，環(huán)形模板的翻譯活性較線性模板低，且具有一定的組織、時序特異性，但不同物種間進(jìn)化保守。

1.3參與親本基因調(diào)控 circRNA參與了mRNA的前期剪接，并可作為親本mRNA轉(zhuǎn)錄的活性啟動子[3]。circRNA通過上調(diào)RNA聚合酶Ⅱ的活性刺激其親本基因轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)其作為RNA聚合酶Ⅱ正向調(diào)節(jié)劑的潛在作用[26]。一些外顯子-內(nèi)含子circRNA(如circEIF3J和circPAIP2)可能通過與核小RNA之間的RNA-RNA相互作用，進(jìn)一步與RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物在啟動子處相互作用，這種非編碼RNA之間特異性的RNA-RNA相互作用，可能是非編碼RNA功能機制的核心主題之一。外顯子-內(nèi)含子circRNA可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄來增加親本mRNA和自身表達(dá)水平[27]。此外，circCNOT2等帶有起始密碼子的circRNA可能通過啟用親本線性mRNA另一個起始密碼子的翻譯來影響親本基因的表達(dá)[2]。

1.4與RNA結(jié)合蛋白的相互作用 RNA結(jié)合蛋白通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)，幾乎在所有細(xì)胞過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細(xì)胞的增殖、分化、運動、衰老、凋亡以及細(xì)胞對應(yīng)激、有絲分裂原和免疫觸發(fā)的反應(yīng)等。circRNA可與不同RNA結(jié)合蛋白相互作用形成特定的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，從而影響相關(guān)蛋白質(zhì)的作用方式或影響自身生物發(fā)生過程[28]。由多聚腺嘌呤結(jié)合蛋白核1基因產(chǎn)生的環(huán)狀多聚腺嘌呤結(jié)合蛋白核1與人抗原R結(jié)合可能會抑制其介導(dǎo)的翻譯過程[29]。在非癌細(xì)胞中高表達(dá)的circFOXO3通過形成circFOXO3-p21-cDK2三元復(fù)合物阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程[30]。由細(xì)胞周期蛋白B1產(chǎn)生的circCCNB1可以與細(xì)胞周期蛋白B1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1相互作用，改變?nèi)橄侔┲幸职┗騪53基因突變的影響[31]。此外，circRNA還可作為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)支架分子，作為非編碼RNA修飾表觀遺傳等作用[32]。circRNA通過其特定的生物學(xué)功能在腫瘤相關(guān)進(jìn)程中起重要作用，circRNA的生物學(xué)功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制仍需要進(jìn)一步探索，以為臨床工作提供新的診療方向。

2 circRNA與不同分子分型乳腺癌

根據(jù)免疫組織化學(xué)染色顯示的乳腺腫瘤關(guān)鍵蛋白的表達(dá)將乳腺癌分為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性乳腺癌、孕激素受體(progesterone receptor,PGR)陽性乳腺癌、人表皮生長因子受體(human epithelial growth factor receptor，HER)2陽性乳腺癌以及缺乏以上3種蛋白質(zhì)標(biāo)記的TNBC。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA不僅與不同分子分型乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程有關(guān)，且與乳腺癌化療過程中的不良反應(yīng)及耐藥性密切相關(guān)[33]。

2.1circRNA與TNBC 與其他乳腺癌亞型相比，TNBC在年輕女性中更常見，其組織學(xué)分級較高，且通常預(yù)后不良。circRNA與TNBC細(xì)胞增殖和腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，還可調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞對治療藥物的耐藥性等[34]。通過RNA測序技術(shù)，circRNA在TNBC組織和相鄰正常組織之間差異表達(dá)，且circRNA表達(dá)水平與TNBC患者臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)。circSEPT9由SEPT9(Septin 9)前體mRNA經(jīng)反向剪接環(huán)化形成，可通過調(diào)控miR-637減輕其對白血病抑制因子的抑制，激活涉及TNBC進(jìn)程的白血病抑制因子/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路，導(dǎo)致TNBC的發(fā)生和發(fā)展[35]。含有蛋白1的Arf GAP結(jié)構(gòu)域和FG重復(fù)序列產(chǎn)生的circAGFG1可通過調(diào)控miR-195-5p減少對G1/S期特異性細(xì)胞周期蛋白E1的抑制，從而促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移并抑制細(xì)胞凋亡[36]。hsa_circ_007294可通過調(diào)控miR-148a-3p和miR-152-3p誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)TNBC的侵襲和轉(zhuǎn)移[37]。上皮基質(zhì)相互作用蛋白1產(chǎn)生的circEPSTI1通過調(diào)控miR-4753和miR-6809，上調(diào)乳腺癌L11A基因的表達(dá)，并影響TNBC的增殖和凋亡。高水平circEPSTI1與TNBC患者生存期縮短有關(guān)[38]。驅(qū)動蛋白超家族成員4A(kinesin family member 4A，KIF4A)產(chǎn)生的circKIF4A通過調(diào)控miR-375上調(diào)癌基因KIF4A的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞的增殖和遷移[39]。circIFI30通過上調(diào)miR-520b-3p靶基因CD44的表達(dá)促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖、侵襲[40]。泛素結(jié)合酶E2 D2環(huán)化產(chǎn)生的circUBE2D2通過調(diào)控miR-512-3p調(diào)節(jié)癌基因CDCA3的表達(dá)，與TNBC不良預(yù)后有關(guān)[41]。circWAC通過調(diào)控miR-142減少miR-142對WW結(jié)構(gòu)域E3泛素蛋白連接酶1基因的抑制作用，調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路的傳導(dǎo)活性，并影響其對紫杉醇的敏感性[33]。由核受體亞家族C組成員2產(chǎn)生的circNR3C2通過miR-513a-3p促進(jìn)TNBC中羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶降解蛋白1介導(dǎo)的腫瘤抑制作用[42]。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶降解蛋白1通過誘導(dǎo)泛素化抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。

2.2circRNA與HER-2陽性乳腺癌 HER-2陽性乳腺癌占所有乳腺癌的20%～30%[43]，具有浸潤性強、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、無病生存期短等特點。對HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺上皮細(xì)胞中circRNA差異表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的circRNA在磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路中顯著富集，并與蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)控活性顯著相關(guān)[44]。HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞中，circRNA表達(dá)譜與正常乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)譜存在顯著差異，差異表達(dá)的circRNA可作為HER-2陽性乳腺癌的潛在診斷或治療靶標(biāo)。有研究表明，與其他亞型乳腺癌患者相比，HER-2陽性乳腺癌患者差異表達(dá)的circRNA數(shù)目更多[45]。TNBC和HER-2陽性乳腺癌樣本中circ-HER2(一種HER-2基因的環(huán)狀形式)的表達(dá)高于鄰近正常組織，且circHER2的狀態(tài)與總生存時間呈負(fù)相關(guān)[45-46]。此外，circHER2還編碼蛋白質(zhì)HER-103。所有HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞系及部分TNBC細(xì)胞系均表達(dá)HER-103，而Luminal型乳腺癌細(xì)胞系不表達(dá)HER-103[46]。HER-103在HER-2陽性乳腺癌中的作用還有待進(jìn)一步研究，但其表達(dá)可能提示circRNA不僅通過miRNA在乳腺癌中發(fā)揮作用，其翻譯功能編碼的蛋白質(zhì)也可能是調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.3circRNA與Luminal型乳腺癌 約70%的乳腺癌為激素受體陽性[43]。已知大量circRNA可被雌激素誘導(dǎo)，對PGR基因產(chǎn)生的雌激素誘導(dǎo)程度最高的6個 circRNA(circPGR1～6)的研究發(fā)現(xiàn)，circPGR作為競爭性內(nèi)源RNA可調(diào)控miR-301a-5p的作用，促進(jìn)ER陽性乳腺癌細(xì)胞的生長和腫瘤發(fā)生[47]。circPGR在ER陽性乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，而靶向circPGR的反義寡核苷酸可有效抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，ER陽性乳腺癌中hsa_circ_0087378下調(diào)，且hsa_circ_0087378/miR-1260b/分泌型卷曲相關(guān)蛋白1軸也被認(rèn)為是調(diào)控ER陽性乳腺癌進(jìn)程的關(guān)鍵途徑[47-48]。hsa_circ_0025202通過調(diào)控miR-182-5p抑制乳腺癌細(xì)胞進(jìn)展，并提高乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬內(nèi)分泌治療的敏感性[49]。通過在線微陣列分析(Gene Expression Omnibus)研究發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，Luminal亞型乳腺癌組織中存在多個差異表達(dá)的circRNA，hsa_circRNA_100689和hsa_circRNA_005239可能參與了Luminal亞型乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與分子調(diào)控進(jìn)程[50]，這可能有助于新型Luminal亞型乳腺癌治療靶點的研究。

circRNA在乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和耐藥中發(fā)揮了巨大的調(diào)控功能。目前，circRNA與乳腺癌的相關(guān)性研究主要集中于其作為競爭性內(nèi)源RNA的海綿作用，circRNA通過翻譯功能和結(jié)合RNA結(jié)合蛋白調(diào)控乳腺癌的潛力有待進(jìn)一步挖掘。與傳統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物相比，circRNA在腫瘤診斷及其預(yù)后判斷中的靈敏度和特異度更高，在乳腺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，使其在血液或尿液中的半衰期延長，為circRNA作為生物標(biāo)志物提供了條件[51]。此外，結(jié)合乳腺癌中特異表達(dá)的蛋白與差異表達(dá)的circRNA有望成為新的治療靶點。

3 小 結(jié)

circRNA的生物發(fā)生不是隨機的剪接錯誤，是RNA家族中繼miRNA后發(fā)現(xiàn)的又一種重要腫瘤調(diào)節(jié)因子。circRNA存在于所有生命形式(包括真核生物、細(xì)菌等)中，證明了circRNA的重要性。乳腺癌發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高，因此急需尋找有效的診斷與治療方法，不同circRNA以及傳統(tǒng)標(biāo)志物的同時檢測可能具有更高的診斷效率。circRNA在癌癥治療中的潛力亦受到重視。靶向circRNA的治療可能成為腫瘤治療的一種新模式。目前已根據(jù)真核生物circRNA的來源、功能、體內(nèi)分布等建立了統(tǒng)一的歸類方法，有助于進(jìn)一步探索其作為診斷性生物標(biāo)志物以及疾病治療靶標(biāo)的潛力。