抗疫病加工型辣椒細胞質雄性不育恢復系的創(chuàng)制

李怡斐，楊小苗，王春萍，段敏杰，黃任中，張世才*

(1 重慶市農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，重慶 401329；2 重慶市農業(yè)科學院生物技術研究所，逆境農業(yè)研究重慶市市級重點實驗室，重慶 401329)

辣椒(CapsicumannuumL.)是世界上廣泛種植的一種作物，可作為蔬菜、香料、食用色素和醫(yī)藥用途。2020年全球辣椒種植面積達161.5萬hm2，產量達415.7萬t(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)。在過去的30年里，朝天椒消費量增長了40倍[1]。目前辣椒雜交種生產主要依靠人工去雄和授粉，不僅生產成本高，種子純度也難以保障。CMS三系雜交制種具有節(jié)約去雄成本、保證雜交種純度、制種產量高和保護品種知識產權等優(yōu)點。

近年來，國內外學者致力于辣椒CMS恢復系分子標記輔助育種研究，已基于RAPD、AFLP和序列同源性開發(fā)了幾個可以預測恢復基因Rf表型的分子標記[2-6]。Gulyas等[7]將RAPD標記OPT-02/570轉成與Rf緊密連鎖的CRF-SCAR標記，遺傳距離為5.3 cM。Kim等[3]將AFRF8轉化為CAPS標記AFRF8CAPS，遺傳距離為1.8 cM。Lee等[5]確定了與CMS育性恢復相關的部分恢復(pr)位點，開發(fā)了與該位點密切連鎖的CAPS標記(PR-CAPS)(距Rf1.8 cM)。與Rf緊密連鎖的分子標記可有效提高篩選CMS恢復系的效率，在苗期即可取葉片進行PCR鑒定，不受季節(jié)的影響。

目前，由辣椒疫霉(phytophthoracapsici)引起的疫病已成為國內外辣椒主產區(qū)最具破壞性的病害之一，每年造成超過1億美元的經濟損失[8]。在強降雨、過度灌溉、排水不暢等條件下更容易引起辣椒疫病發(fā)生[9-10]。迄今為止，除化學防治外尚未有有效和安全的措施防治疫病[11-13]。因此，利用抗病品種已成為解決辣椒疫病發(fā)生的簡單、有效、安全的途徑。植物育種家也把重點放在培育高抗性品種上。Quirin等[14]開發(fā)了一個與辣椒疫病緊密連鎖的SCAR分子標記FQ01/RQ01。李怡斐等[15]利用SLAF-seq構建了辣椒高密度遺傳圖譜，該圖譜包含12個連鎖群，5 565個標記，并對疫病抗性進行了QTL定位。這些為分子標記的開發(fā)以及利用MAS培育抗病品種提供了技術支撐。

當前，花藥培養(yǎng)技術可以更快速、更節(jié)約地創(chuàng)制性狀純合的育種(純)系，大大減少創(chuàng)制育種純系所需的世代數，從而降低育種工作的成本[16]。近年來，國內外科研工作者通過花藥培養(yǎng)技術獲得了一批DH系。Cabuk等[17]以辣椒Clrgalan和P1(抗疫病)BC2F2為供試親本進行辣椒花藥培養(yǎng)，結合分子標記輔助選擇獲得25個抗疫病的辣椒純系。李怡斐等[18]采用花藥培養(yǎng)技術與MAS技術相結合的方法創(chuàng)制了3個性狀優(yōu)良的加工型辣椒CMS恢復系。隨后，李怡斐等[19]利用花藥培養(yǎng)技術與MAS相結合的方法創(chuàng)制了14個抗疫病雙單倍體(doubled haploid，DH)株系。重慶位于中國西南地區(qū)，夏季高溫多雨天氣容易誘發(fā)辣椒疫病大面積爆發(fā)，為了更好地解決制種純度和辣椒疫病問題，培育抗疫病的CMS恢復系就成為是解決該問題的唯一方法。

本研究為創(chuàng)制抗疫病加工型辣椒CMS恢復系材料，以長果、單生朝天椒作母本，以抗疫病恢復系為父本，利用雜交、花藥培養(yǎng)和MAS相結合的方法，開展抗疫病CMS恢復系的創(chuàng)制，以期獲得單生、長果的抗疫病CMS恢復系，為利用三系配套選育加工型辣椒抗病新品種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本課題組選用抗疫病恢復系939-1和1021(1)-1為抗疫病和恢復基因供體親本，以長果、單生自交系481-4-10作為受體親本，配制雜交組合。

1.2 方 法

1.2.1 花藥培養(yǎng)2017年5～7月在重慶市農業(yè)科學院生物技術研究所以(481-4-10×939-1)F1和[481-4-10×1021(1)-1]F1為供體親本進行花藥培養(yǎng)。上午9點前摘取處于單核靠邊期的花蕾置于冰盒中帶回實驗室。在超凈工作臺上用70%酒精表面消毒30 s，隨后用0.1% HgCl2消毒7 min，無菌水漂洗4次，之后將花蕾置于裝有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中。無菌條件下將花藥接種于胚狀體誘導培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D+3%蔗糖+7 g/L瓊脂+4 mg/L AgNO3+0.04%活性炭)，9 mm×9 mm培養(yǎng)皿接6個花蕾的花藥，35 ℃高溫預處理5 d[20]。

1.2.2 再生植株倍性鑒定以 939-1 正常二倍體為對照，分別取對照和花培再生植株的新鮮嫩葉1～2 片，標記后送北京紅山風尚科技有限公司進行倍性檢測。倍性檢測的儀器為Partec公司的CyFlow Space，所用試劑為 Partec CyStain UV Precise P 快速倍性分析試劑盒。取0.5 cm2的新鮮葉片，置于培養(yǎng)皿中，加入400 μL 核酸提取緩沖液(Nuclear Extraction Buffer)，用鋒利刀片切碎，放置10 s，再用30μm濾網將樣本過濾至樣品管中，加入 600 μL 染色緩沖液(Staining Buffer)，輕微混勻，即可上機測試。

1.2.3 分子標記輔助選擇鑒定采用Gulyas等[7]開發(fā)的CRF-SCAR標記鑒定辣椒花培DH系是否攜帶Rf基因， CRF-SCAR引物序列為F(5′-ATT-TTCAGATTGTGGCGACG-3′)和R(5′-CGACC-ATCACGACGAGG-3′)。利用Quirin等[14]開發(fā)的與辣椒抗疫病QTL位點Phyto.5.2.緊密連鎖的FQ01/ RQ01標記鑒定辣椒DH系的疫病抗性。引物為FQ01(5′-CCATAAGGGTTGGTAAATTTA-CAAAG-3′)和RQ01(5′-TCGAGAGATAATTC-AGATAGTATAATC-3′)，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

本研究采用CTAB法提取辣椒葉片DNA。反應體系為20 μL，基因組DNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，滅菌水20 μL。PCR反應程序為94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 1 min。

1.2.4 苗期抗性鑒定采用灌根接種法鑒定辣椒花培DH系的疫病抗性，參照NY/T2060.1-2011《辣椒抗病性鑒定技術規(guī)程-辣椒抗疫病鑒定技術規(guī)程》。在幼苗6葉展平期進行，接種前澆透水，用手術刀在距離幼苗根部3 cm處斷根，用移液器吸取5 mL游離孢子濃度為1×105個/mL孢子懸浮液注入辣椒幼苗根部附近。接種后將植株置于白天溫度25～28 ℃、夜間溫度為20～22 ℃的培養(yǎng)室，每天光照10～12 h，使基質濕度保持近飽和狀態(tài)。接種后7 d調查記載各級病株數。病情級別劃分及抗性評價方法參照辣椒抗疫病鑒定技術規(guī)程的標準。

1.2.5 DH系農藝性狀調查小區(qū)1.333 m×4.0 m，雙行單株種植，每小區(qū)種植20株，3次重復。結果盛期進行農藝性狀調查，用卷尺測量株高和冠幅，調查始花節(jié)位、果實朝向、單株結果和果形等。隨后摘取辣椒紅熟果實進行室內考種，包括果長、果寬和辣味等。

1.2.6 測交驗證以481-4-1A和0313932A不育系分別作測交親本(母本)，以DH系為測交父本，驗證DH系對不育系的育性恢復能力。盛花期分別取DH系開放的花，分別與481-4-1A和0313932A授粉，授粉后做好標記，共授粉4次，每個DH系測交5株。調查測交后代的育性，育性記載為恢復株率。

2 結果與分析

2.1 DH系的獲得

2017年春季進行辣椒花藥培養(yǎng)，每個雜交組合接種40皿，每皿接種6枚花藥，共接種240枚花藥。結果表明：供體親本(481-4-10×939-1)F1經花藥培養(yǎng)共誘導出22個胚狀體，誘導率為9.17%。其中成苗的有19個，移栽成活后經人工加倍，11個花培再生苗可正常結實，經倍性鑒定均為二倍體(圖1)，即得到了11個花培DH系；[481-4-10×1021(1)-1]F1經花藥培養(yǎng)共誘導出20個胚狀體，誘導率為8.33%，其中成苗14個，移栽成活后經人工加倍，9個花培再生苗可正常結實，即獲得9個DH系。

A.939-1(二倍體)；B.花培再生植株(二倍體)

2.2 分子標記輔助選擇

采用分子標記CRF-SCAR鑒定花培DH系是否攜帶Rf基因，該標記在可育材料中可擴增出870 bp的特異條帶，在不育材料中則無特異條帶。PCR擴增結果表明(圖2，表1)，由供體(481-4-10×939-1)F1獲得的11個DH系中有7個可擴增出870 bp的特異條帶，占63.6%；而來自供體[481-4-10×1021(1)-1]F1的9個DH系中有8個擴增出870 bp的特異條帶，占88.9%。

M. DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1獲得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的DH系

采用分子標記FQ01/RQ01驗證花培DH系的疫病抗性，該標記在抗疫病材料可PCR擴增出717 bp大小的特異條帶，感疫病材料則無特異條帶。試驗結果表明(圖3)，供體(481-4-10×939-1)F1獲得的11個DH系中有5個DH系擴增出條帶大小為717 bp的特異條帶，初步認為這5個DH系抗疫病，占45.5%；而供體[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的9個DH系中有4個擴增出717 bp的特異條帶，占44.4%。

M.DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1獲得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的DH系

由此可知，通過MAS技術初步篩選到7個含Rf的抗疫病DH系，分別命名為‘渝辣選3-2’、‘渝辣選3-3’、‘渝辣選3-5’、‘渝辣選7-1’、‘渝辣選7-5’、‘渝辣選7-6’和‘渝辣選7-9’，需進一步通過苗期抗性鑒定明確其抗性。

2.3 苗期抗性鑒定

為了進一步明確花培DH系的疫病抗性，采用灌根接種法鑒定MAS技術初選的抗疫病DH系的疫病抗性，以PI201234為抗病對照，以Early calwonder為感病對照，接種辣椒疫霉菌后7 d調查病情(圖4)，根據農業(yè)部辣椒抗疫病鑒定行業(yè)標準關于依據辣椒疫病病情指數劃分參試品種抗病類型的標準，苗期抗性鑒定試驗結果表明，7個DH系的病情指數介于18.1～36.8之間，其中5個DH系抗疫病，2個中抗疫病(表1)，說明這7個DH系較抗疫病。

A.PI201234；B.Early calwonder；C.渝辣選3-2 Yulaxuan 3-2

表1 辣椒DH系疫病抗性鑒定

2.4 農藝性狀

盛果期調查攜帶Rf基因的7份抗疫病DH系的農藝性狀(表2)，調查結果表明，各DH系的株高介于69.3～88.0 cm，以‘渝辣選7-9’株高最高；冠幅范圍在71.5～78.5 cm之間，以‘渝辣選7-1’的冠幅最大；始花節(jié)位在9.0～14.3節(jié)之間，以‘渝辣選3-3’的始花節(jié)位最高；5個DH系果實均為單生向上，果形為羊角和牛角；果長介于10.3～15.1 cm，以‘渝辣選7-5’果最長；果寬范圍在1.5～2.1 cm之間，以‘渝辣選7-5’果寬最大；單株結果數介于48.9～97.4個，以‘渝辣選3-2’最多，為97.4個；其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’味辣，其余為微辣。綜上所述，其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’果實是單生、長果朝天椒，味辣，可作為親本進行加工型辣椒新品種選育。

表2 辣椒DH系農藝性狀調查

2.5 測交驗證

2019年以481-4-1A和0313932A不育系分別作母本，以DH系‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’分別作父本，測交驗證DH系的育性恢復性。將測交后代定植于國家農作物改良中心(重慶分中心)基地，調查花粉育性(表3)。各測交組合的測交株系均表現可育，各測交株系的恢復株率均為100%。表明‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’均為CMS恢復系，田間調查結果與分子標記輔助選擇結果一致。

表3 測交驗證DH系對CMS不育系的恢復性

3 討 論

據報道，已在150多種植物中發(fā)現了CMS，用于簡化F1雜交種子生產中繁重的去雄和人工授粉[21]。但是，目前辣椒上只有極少數品種能應用三系配套進行雜種一代生產[22-23]。主要是由于辣椒育種中CMS恢復系較少，且恢復系的選育較難，因此對于恢復系的選育研究十分重要。然而，通過傳統(tǒng)育種技術選育CMS恢復系費時、費工，而通過花藥培養(yǎng)與常規(guī)育種技術、分子標記輔助選擇技術的有效結合，在2～3年內可以培育出聚合多種性狀的DH系。目前，育種家們已經利用花藥培養(yǎng)創(chuàng)制了一些優(yōu)異的新種質[19,24-27]。

本研究通過常規(guī)育種和花藥培養(yǎng)技術將抗疫病恢復系939-1和1021(1)-1的Rf基因和抗病基因導入長果、單生自交系481-4-10，用與Rf基因緊密連鎖的CRF-SCAR標記檢測DH系的育性恢復性，然后采用FQ01/RQ01標記檢測各DH系的疫病抗性。苗期抗性鑒定進一步明確DH系的疫病抗性。最終經PCR檢測與苗期抗性鑒定出5個攜帶Rf的抗疫病DH系。盛花期調查5個DH系的農藝性狀，其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’綜合農藝性狀優(yōu)良。采用測交法進一步驗證2個DH系對不育系481-4-1A和0313932A的恢復性，兩個不育系各測交組合的DH系測交株系的恢復株率均為100%。由此可見，將常規(guī)育種、生物技術和分子標記輔助選擇技術有機結合是創(chuàng)制辣椒新種質的捷徑，顯著縮短了育種材料的純化時間，從而加快育種進程。

利用花藥培養(yǎng)技術快速將幾個性狀或基因進行聚合最關鍵的一個環(huán)節(jié)是MAS技術，如果已有與目標基因緊密連鎖的分子標記，可通過PCR擴增快速對目標基因進行篩選。該技術已經在水稻上廣泛應用，王興春等[28]利用分子標記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結合快速聚合水稻白葉枯病抗性基因，獲得16株攜有xa5基因。宋丁丁等[25]利用花藥培養(yǎng)和分子標記選擇相結合改良了水稻稻瘟病和褐飛虱抗性。孫海波等[26]利用花藥培養(yǎng)快速培育聚合抗3種水稻病害基因的新種質14個。本研究利用花藥培養(yǎng)與分子標記輔助選擇技術創(chuàng)制了2個長果、單生抗疫病兼CMS恢復的DH系，可用于培育長果朝天椒品種的選育，進而降低生產成本。說明花藥培養(yǎng)技術與分子標記輔助選擇相結合是根據育種目標而創(chuàng)制新種質的有效途徑。

花藥培養(yǎng)與MAS的有效結合，從供體親本配制到分子標記鑒定、抗病性鑒定和測交驗證僅用2～3年(與南繁結合)，高效培育出攜帶Rf基因兼抗疫病的辣椒DH系，即CMS恢復系，比常規(guī)育種快，顯著提高了育種效率。隨著現代生物技術的迅猛發(fā)展，與各種性狀緊密連鎖的分子標記不斷涌現，花藥培養(yǎng)效率不斷提高，通過該方法實現性狀聚合有望在育種實踐中得到廣泛的應用。