Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化肝泰舒顆粒提取工藝*

趙美峰 吳琳* 宋小妹 仝敏 岳明

(1.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

肝臟是維持生命正常活動(dòng)的一個(gè)必不可少的器官。肝臟發(fā)生病變對(duì)人體的危害性無(wú)疑是巨大的，相關(guān)資料顯示[1]，慢性乙肝2005年—2014年間在某地區(qū)呈上升趨勢(shì)，且出現(xiàn)5年一個(gè)小高峰。肝病已經(jīng)成為全世界除AIDS以外最難治愈的疾病之一[2]。近年來(lái)，中醫(yī)學(xué)在治療肝纖維化、肝硬化、肝腹水等肝臟疾病的研究方面也取得了良好的發(fā)展[3-5]，大量臨床成果證實(shí)中藥在治療肝病上存在多靶點(diǎn)、藥效溫和、適用廣泛、療效顯著等優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)采用辨證施治，與西醫(yī)治療相比，采用保肝治療，優(yōu)勢(shì)在于強(qiáng)調(diào)標(biāo)本兼治，對(duì)于不同時(shí)期肝硬化患者具有不同療效[6-10]。肝泰舒顆粒為院內(nèi)驗(yàn)方，由茵陳、板藍(lán)根、白芍、柴胡、茯苓、虎杖、土茯苓、五味子、當(dāng)歸、白花蛇舌草10味中藥組成，其中君藥茵陳有抗炎、抗病毒作用[11]；白芍有抗炎、保肝作用[12]；柴胡有抗病毒、保肝、調(diào)節(jié)免疫等作用[13]；五味子有顯著的保肝降酶作用[14]；虎杖有保護(hù)肝細(xì)胞、抗肝纖維化及抗肝癌作用[15]。全方共奏益氣健脾、柔肝疏肝、清熱解毒、利水消腫之功效，可用于治療急性傳染性肝炎、慢性遷延性肝炎，慢性活動(dòng)性肝炎，肝硬化及肝硬化腹水。該方自2002年批準(zhǔn)以來(lái)，在我院已有近二十年的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，其臨床效果突出。但隨著中醫(yī)藥發(fā)展進(jìn)程不斷加快，中藥制藥工藝及檢驗(yàn)技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，而肝泰舒顆粒未曾有過(guò)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面突破性的提升，為進(jìn)一步驗(yàn)證產(chǎn)品工藝的可行性，擬開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UV-2102C型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)；SQ8200HD型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；HH-2型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；GB204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Waters e 2695高效液相色譜儀(上海硅儀生化科技有限公司)。

1.2試藥 藥材飲片均購(gòu)自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司；芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：HP2024S1，寶雞辰光生物科技有限公司)；乙腈色譜純；甲醇、乙醇、磷酸等為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1芍藥苷含量測(cè)定方法的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱：Hypurity C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(12∶88)；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2對(duì)照品溶液制備 稱(chēng)取干燥至恒重的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液制備 精密稱(chēng)定樣品1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入稀乙醇25 mL，稱(chēng)重，超聲(功率240 W，頻率100 Hz)20 min，放冷，稱(chēng)重，以稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4陰性對(duì)照溶液制備 取不含白芍藥材的處方中其他藥材制成的陰性樣品，處理方法按供試品制備方法，即得。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

2.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下制備好的對(duì)照品溶液，加甲醇依次稀釋至濃度為0.050，0.125，0.200，0.250和0.375 mg·mL-1。在“2.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積，以芍藥苷的濃度(X，mg·mL-1)與峰面積(Y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：Y=8514677.85X-464460.18，r=0.9998。芍藥苷濃度在0.050～0.500 mg·mL-1范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)針6次，每次10 μL，測(cè)定其峰面積，芍藥苷的RSD值為1.16 %。結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.1.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取一組樣品溶液，分別在 0，3，6，9，12和24 h按以上色譜條件測(cè)定。結(jié)果芍藥苷峰面積的RSD值為1.56 %，表明本品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品，平行稱(chēng)取6份，分別制成供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果芍藥苷平均含量為7.35 mg·g-1，RSD值為1.56%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份已知含量的供試品液0.5 g，精確加入3.8 mg的芍藥苷對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷平均回收率為98.95 %，RSD值為2.57%，表明回收率良好。

2.2浸膏得率測(cè)定 精密量取20 mL水提液至干燥至恒重的蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴蒸干，置105℃烘箱內(nèi)干燥3 h，稱(chēng)重，計(jì)算其浸膏得率[16]。干浸膏得率(%)=干浸膏重量(g)×水提液總體積÷提取飲片總重量(g)×量取水提液的體積×100%。

2.3單因素試驗(yàn)

2.3.1煎煮次數(shù)的考察 將加水量固定為10倍，煎煮60 min，分別考察煎煮1，2，3和4次干浸膏得率。結(jié)果為干浸膏的得率呈上升趨勢(shì)，但煎煮4次比煎煮3次增加不明顯，說(shuō)明藥材溶出率已基本達(dá)到飽和，結(jié)合實(shí)際提取次數(shù)確定為3次，見(jiàn)圖2。

圖2 煎煮次數(shù)的考察

2.3.2加水量的考察 將煎煮次數(shù)固定為2次，煎煮60 min，分別考察加8，10，12，14，16倍量水的提取液中干浸膏的得率。結(jié)果為干浸膏得率在加8～14倍量水區(qū)間呈上升趨勢(shì)，8～12倍量水區(qū)間呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到14倍量水時(shí)，變化趨于平緩，因此選擇14倍量水作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的加水量，見(jiàn)圖3。

圖3 加水量的考察

2.3.3煎煮時(shí)間篩選 將加水量固定為10倍量，煎煮2次，考察煎煮30，60，90和120 min的水提液中干浸膏的得率。結(jié)果為干浸膏得率在煎煮90 min之前呈明顯上升趨勢(shì)，煎煮90 min往后，干浸膏增加量趨于平緩，因此選擇90 min作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取時(shí)間，見(jiàn)圖4。

圖4 煎煮時(shí)間的考察

2.4響應(yīng)面法試驗(yàn) 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)水提工藝影響較大的煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時(shí)間為考察因素，并確定三個(gè)水平，以方中芍藥苷的含量和干浸膏得率為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[17-19](權(quán)重系數(shù)為芍藥苷含量為70%，干浸膏的率為30%)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)并進(jìn)行分析，見(jiàn)表1、表2、表3。

表1 因素與水平表

從方差分析表可以看出，模型P<0.0001，差異非常顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明二次多元回歸模型良好，回歸方程為：

Y=0.0475+0.0206A+0.0337B+0.0219C-0.0002AC-0.0116A2-0.0164B2-0.0094C2

因素AB相互作用不顯著；AC相互作用較為顯著；BC相互作用顯著，各因素對(duì)提取工藝影響的主次順序?yàn)椋築(加水量)>C(煎煮時(shí)間)>A(煎煮次數(shù))。而r=0.9899，差異系數(shù)CV=4.09%，表明模型模擬程度良好，相關(guān)度良好，試驗(yàn)誤差較??；F失擬=1.61，P=0.3198>0.05，模型失擬度不顯著，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。見(jiàn)圖5、圖6、圖7。

表3 方差分析表

圖5 AB相互關(guān)系

圖6 AC相互關(guān)系

圖7 BC相互關(guān)系

綜上擬合的最優(yōu)水提工藝為煎煮時(shí)間95 min；加水量14倍；煎煮次數(shù)3次。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定最佳提取工藝為煎煮時(shí)間為90 min，加14倍水，煎煮3次。按照最佳工藝進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果芍藥苷平均含量為0.0879%；干浸膏平均得率為34.06%。見(jiàn)表4。

表4 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

肝泰舒顆粒方中主藥白芍柔肝養(yǎng)血、緩急止痛, 其中芍藥苷具有抗肝纖維化的作用[20]，且在煎煮過(guò)程中能很好的溶出和保留，本實(shí)驗(yàn)擬根據(jù)芍藥苷含量和水提液干浸膏得率為指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)分，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，設(shè)計(jì)三因素三水平，擬合二次多項(xiàng)方程，推導(dǎo)最佳提取工藝參數(shù)，并通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)考察肝泰舒顆粒的水提工藝的準(zhǔn)確性，該模型預(yù)測(cè)性好，簡(jiǎn)便實(shí)用，克服正交試驗(yàn)只能對(duì)孤立的點(diǎn)進(jìn)行分析的缺點(diǎn)[21]，優(yōu)選出了肝泰舒顆粒的最佳水提工藝參數(shù)，可為該制劑的工業(yè)化大生產(chǎn)提供可靠方案依據(jù)。