洋金花生品、炮制品的急性毒性和亞慢性毒性比較分析*

高楊 李婭 秦昆明 楊超 孫戡平 劉晴, 鄭琳玉, 蔡寶昌, 金俊杰**

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，江蘇 南京 210061；3.南京海源中藥飲片有限公司，江蘇 南京 210061；4.南京中醫(yī)藥大學(xué) 國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023)

洋金花Daturaeflos為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.的干燥花，性味，辛溫；有毒[1]。洋金花為《中國(guó)藥典》2020年版一部收藏品種，只包含生品洋金花。洋金花炮制品制洋金花，只有《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[2]收載：將生洋金花用生姜汁拌勻，待吸透，略潤(rùn)，切成1～2 mm細(xì)絲，置鍋內(nèi)，炒干，趁熱噴灑白酒，拌勻，稍悶，晾干(每生洋金花100 kg，用生姜25 kg打汁，60°白酒12.5 kg)。項(xiàng)目組已對(duì)制洋金花的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化研究[3]，得出以東莨菪堿含量和水分含量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察生姜打汁后加水量、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度、炒制時(shí)間4項(xiàng)指標(biāo)，確定制洋金花的最佳炮制工藝，篩選出制洋金花的最佳工藝參數(shù)為生姜打汁后加水量3倍，悶潤(rùn)時(shí)間40 min，炒制溫度270～300 ℃、炒制時(shí)間5 min，炮制后的洋金花有酒香氣和微姜味。臨床上內(nèi)服中毒報(bào)道多由誤服或用量過(guò)度所導(dǎo)致，臨床上報(bào)道洋金花急性中毒6例[4]。目前未見(jiàn)洋金花炮制品制洋金花急性毒性和亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，對(duì)制洋金花的毒性實(shí)驗(yàn)研究可以擴(kuò)大制洋金花的用藥范圍，提高制洋金花的用藥安全性，更好地將制洋金花運(yùn)用于臨床以及提供更好的用藥合理性，本研究對(duì)洋金花生品和炮制品進(jìn)行急性毒性和亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 JJ600A型電子天平[美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司];JYZ-D57榨汁機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司)。

1.2藥材 洋金花(產(chǎn)地安徽)和生姜(產(chǎn)地山東)，購(gòu)自南京海源中藥飲片公司(以下簡(jiǎn)稱海源)。洋金花10批(產(chǎn)地分別為內(nèi)蒙、安徽、吉林、河北、廣西、山東、山西、河南、廣東、江西)，購(gòu)自安國(guó)市聚福中藥材有限公司(以下簡(jiǎn)稱聚福)。洋金花經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司首席質(zhì)量官執(zhí)業(yè)中藥師丁斐鑒定，為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.的干燥花。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠92只，雌雄各半，體重18～22 g，SPF級(jí)，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：201912724。

2 方法

2.1制洋金花樣品制備[3]取50 g洋金花樣品(海源1批，聚福10批)，用生姜12.5 g打汁后加3倍水，25 ℃下悶潤(rùn)40 min后切碎，在270～300 ℃下炒制5 min，29～30 ℃下噴灑6.25 g的60°白酒后，25 ℃下悶30 min，晾干。

2.2洋金花水提取物制備 洋金花樣品(海源1批次)，剪碎，用8倍體積的純化水于圓底燒瓶?jī)?nèi)浸泡0.5 h，電熱套加熱，回流提取，藥液沸騰后調(diào)整溫度至藥液微沸，繼續(xù)煮1 h后，濾過(guò)藥液，重復(fù)2次，將濾液合并濃縮，得到洋金花水提取物，生藥含量濃度1 g·mL-1。

2.3制洋金花水提取物制備 以制洋金花樣品(海源1批，聚福10批)，剪碎，用8倍體積的純化水于圓底燒瓶?jī)?nèi)浸泡0.5 h，電熱套加熱，回流提取，藥液沸騰后調(diào)整溫度至藥液微沸，繼續(xù)煮1 h后，濾過(guò)藥液，重復(fù)2次，將濾液合并濃縮，得到洋金花水提取物，生藥含量濃度1 g·mL-1。

2.4最大給藥量急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn) 選取ICR小鼠4只，雌雄各半，體重為18～22 g，分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食24 h，以制洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重最大灌胃給藥體積0.4 mL，一次性灌胃給藥，給藥后給飼料，自由飲水，觀察24 h，記錄小鼠死亡情況，脫頸椎處死后，解剖觀察臟器。給藥后，小鼠飲食和活動(dòng)正常，毛色正常，無(wú)死亡情況，解剖觀察心、肺、胸腺、肝、脾、腎均正常，切開(kāi)小鼠胃后，肉眼觀察有飼料，未有制洋金花水提取物，給藥前后的小鼠體重未出現(xiàn)大幅下降。

2.5最大耐受量急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn) 選取ICR小鼠8只，雌雄各半，體重為18～22 g，分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食24 h，以制洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，1 d內(nèi)2次和3次灌胃給藥，末次給藥后給予小鼠飼料，自由飲水，觀察24 h，均無(wú)小鼠死亡情況，各臟器正常，肉眼觀察胃部有飼料，未有制洋金花水提取物。

由預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，以1 d內(nèi)給藥3次的最大耐受量急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)開(kāi)展最大耐受量急性毒性正式實(shí)驗(yàn)；以最大給藥量急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)開(kāi)展亞慢性期毒性正式實(shí)驗(yàn)。

2.6最大耐受量急性毒性正式實(shí)驗(yàn) 選取ICR小鼠56只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，空白組8只，制洋金花(海源1批，聚福10批)水提物組各4只，洋金花(海源1批次)水提取物組4只。除空白組小鼠外，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食24 h，制洋金花(海源1批，聚福10批)水提取物給藥組小鼠，以制洋金花(海源1批，聚福10批)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，1 d內(nèi)3次灌胃給藥，洋金花(海源1批次)水提取物組小鼠，以洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，1 d內(nèi)3次灌胃給藥，末次給藥后給予飼料，小鼠自由飲水，觀察7 d，記錄小鼠體重和死亡情況，第7 d后，脫頸椎處死小鼠后，解剖觀察小鼠臟器。

2.7亞慢性毒性正式實(shí)驗(yàn) 選取ICR小鼠24只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，空白組8只，制洋金花(海源1批次)水提物組16只。除空白組小鼠外，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食24 h，制洋金花(海源1批次)水提取物給藥組小鼠，以制洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，每天灌胃前禁食3 h，灌胃給藥1次，給藥后給予飼料，小鼠自由飲水，連續(xù)給藥7 d，記錄小鼠體重和死亡情況，末次給藥24 h后，脫頸椎處死小鼠后，解剖觀察小鼠臟器，稱脾、腎重，記錄臟器系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1最大耐受量急性毒性正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)觀察期間，各組小鼠飲食和活動(dòng)正常，毛色光澤，生長(zhǎng)良好，未見(jiàn)中毒表現(xiàn)，無(wú)死亡情況，7 d后處死小鼠，肉眼觀察小鼠心、肺、胸腺、肝、脾、腎均正常，各器官均無(wú)異常，給藥組各組小鼠體重呈上升趨勢(shì)，組間無(wú)顯著性差異。因此，以人60 kg體重及制洋金花臨床最大用藥量1.5 g，小鼠MTD>120 g·kg-1，相當(dāng)于60 kg體重人用藥量的4800倍，屬無(wú)毒類。最大耐受量急性毒性正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 最大耐受量急性毒性正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2亞慢性毒性正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)觀察期間，各組小鼠飲食和活動(dòng)正常，毛色光澤，生長(zhǎng)良好，未見(jiàn)任何中毒表現(xiàn)，無(wú)死亡，7 d后處死小鼠，肉眼觀察小鼠心、肺、胸腺、肝、脾、腎均正常，各器官均無(wú)異常，給藥組各組小鼠體重呈上升趨勢(shì)，組間無(wú)顯著性差異，脾臟和腎臟系數(shù)組間無(wú)顯著性差異。因此，制洋金花以小鼠每日給藥劑量以體表面積換算人(20 g小鼠體表面積為1，60 kg體重人體表面積等效量為346)每日給藥劑量為276.8 g，顯著大于臨床用量1.5 g，是臨床用量的184倍，臨床7 d內(nèi)使用制洋金花可以加大劑量使用。亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 亞慢性毒性正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

對(duì)于毒性中藥，既要在工藝優(yōu)化，也要提高臨床用藥劑量安全性，達(dá)到減毒增效的目的[5-7]。在中藥炮制減毒增效方面研究，從醋制減毒入肝、增效角度就來(lái)研究醋制中藥[8]；汗?jié)n法炮制了哥王藥材中芫花素的含量有所降低，抗氧化活性增強(qiáng)，具有減毒增效效果[9]；去油制霜可影響美洲大蠊脂溶性成分含有量及小分子多肽Papp，可能是其減毒增效的機(jī)制[10]；黃精經(jīng)過(guò)炮制后成分有顯著變化，九蒸九制的黃精具有減毒增效的作用[11]。開(kāi)展毒性藥材動(dòng)物實(shí)驗(yàn)必不可少，以急性毒性和亞慢性毒性試驗(yàn)聯(lián)合開(kāi)展，結(jié)果顯示：按臨床劑量使用地黃提取物是安全無(wú)毒的，夏枯草浸膏屬于無(wú)毒級(jí)物質(zhì)，翅果仁屬于實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)，槐定堿具有一定毒性，但停止染毒30 d后肝、腎等實(shí)質(zhì)器官損傷可得到恢復(fù)[12-16]。

通過(guò)最大耐受量和最大給藥量急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行研究，有助于急性毒性和亞慢性毒性正式實(shí)驗(yàn)合理設(shè)計(jì)，以1 d內(nèi)給藥3次的最大耐受量急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)開(kāi)展最大耐受量急性毒性正式實(shí)驗(yàn)；以最大給藥量急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)開(kāi)展亞慢性期毒性正式實(shí)驗(yàn)。

最大耐受量急性毒性試驗(yàn)結(jié)果得出，洋金花生品和炮制品急性毒性試驗(yàn)小鼠MTD大于120 g·kg-1，最大耐受倍數(shù)為4800倍，屬于無(wú)毒。給予洋金花和制洋金花后，小鼠均無(wú)毒性反應(yīng)，組間體重?zé)o顯著性差異，表明洋金花炮制前后毒性反應(yīng)無(wú)差異。亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果得出，制洋金花以小鼠每日給藥劑量以體表面積換算人(20 g小鼠體表面積為1，60 kg體重人體表面積等效量為346)每日給藥劑量為276.8 g，顯著大于臨床用量1.5 g，是臨床用量的184倍，臨床7 d內(nèi)使用制洋金花可以加大劑量使用。

洋金花作為一種毒性藥材，在毒性實(shí)驗(yàn)研究方面較少報(bào)道：洋金花對(duì)鯉、鳊和白鰱具有劑量致死性，白鰱致死劑量最低[17]；對(duì)家兔和豚鼠皮膚毒性試驗(yàn)表明無(wú)刺激性和致敏性[18]；洋金花靜脈滴注大鼠，可以短暫興奮，隨即減弱，3 d恢復(fù)正常[19]；曼陀羅種子對(duì)小鼠的灌胃致死中量分別為19.05 g·kg-1和23.53 g·kg-1體重[20]。以上文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)取得的研究結(jié)果分析洋金花對(duì)各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生毒性反應(yīng)、藥材不同給藥方式毒性反應(yīng)和藥材不同用藥部位產(chǎn)生毒性反應(yīng)進(jìn)行比對(duì)，表明洋金花對(duì)魚(yú)類毒性反應(yīng)較大；藥材不同給藥方式毒性反應(yīng)：靜脈滴注>口服>經(jīng)皮給藥；藥材不同用藥部位毒性反應(yīng)：種子的毒性大于花的毒性。本次實(shí)驗(yàn)中炮制前后的洋金花，急性毒性無(wú)差異，推測(cè)其毒性在動(dòng)物整體毒性反應(yīng)上表現(xiàn)不明顯，可能在臟器長(zhǎng)期蓄積有關(guān)，或者由于洋金花含有東莨菪堿成分和其用于外科麻醉的作用，多作用于中樞神經(jīng)，下一步將繼續(xù)開(kāi)展制洋金花的毒性研究，同時(shí)查找出制洋金花中的毒性成分開(kāi)展研究，特別是對(duì)中樞神經(jīng)藥效毒性作用。