褪黑素預(yù)處理對(duì)老年大鼠骨骼肌缺血再灌注后認(rèn)知功能的影響

李琳 夏洪蓮 張?jiān)马?胡春陽(yáng) 崔曉爽 蘆相玉

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江牡丹江 157011

褪黑素在牛的松果體中提取，其能分泌一種具有神經(jīng)內(nèi)分泌活性的物質(zhì)，進(jìn)入血液中，參與血液循環(huán)，從而對(duì)身體各器官和組織細(xì)胞發(fā)揮對(duì)應(yīng)的作用。目前許多研究證實(shí)，褪黑素可以參與許多生物調(diào)節(jié)過(guò)程，如節(jié)律性、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，甚至用于腫瘤的防治、催眠鎮(zhèn)痛、清除自由基及延緩衰老等[1-4]。術(shù)后認(rèn)知功能障礙（post operative cognitive dysfunction，POCD）是指術(shù)后記憶力、學(xué)習(xí)力、認(rèn)知力等功能受到一過(guò)性甚至永久性損傷，致使社會(huì)活動(dòng)能力減退[5]。但POCD 發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，目前對(duì)POCD 的發(fā)生機(jī)制主要傾向于應(yīng)激、創(chuàng)傷所引起的炎性反應(yīng)，多數(shù)認(rèn)為血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的釋放與POCD的產(chǎn)生密切相關(guān)[6,7]，因褪黑素與免疫、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和清除自由基功能有關(guān)[8,9]，故本實(shí)驗(yàn)旨在探討褪黑素是否可以通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)降低 POCD 的發(fā)生，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

褪黑素（西亞化學(xué)科技有限公司），Rat IL-6 ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），DW-2000 型小型動(dòng)物呼吸機(jī)（上海嘉鵬科技有限公司）、Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）、低溫冰箱（SANYO MDF-436）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康雄性老年大鼠64 只（24 月齡，體質(zhì)量300～350g），飼養(yǎng)環(huán)境22～26℃，濕度40%～47%，無(wú)聲、光等刺激，充足食物及水分供應(yīng)，光照時(shí)間12h，黑暗循環(huán)，64 只大鼠均按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，由牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（黑）2019-006。大鼠來(lái)源于SPF 級(jí)動(dòng)物房，黑白周期各為12h，自由攝食飲水。經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院倫理委員會(huì)許可，操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法分4 組，每組16 只（n=16），分為空白組（blank group，B 組）、對(duì)照組（control group，C 組）、氯化鈉組（sodium chloride group，NS 組）和褪黑素組（melatonin group，MT 組）。

1.4 模型制備

根據(jù)Murata等[10]缺血再灌注模型制備方法加以利用改進(jìn)，予5%戊巴比妥鈉溶液，以50mg/kg 劑量腹腔注射誘導(dǎo)麻醉，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用加溫毯，將體溫保持37℃。為了壓縮雙側(cè)后肢，根據(jù)Murata等[10]的修改方法，將Rosenthal13 用于小鼠的卡式止血帶制備一對(duì)橡膠止血帶。在金屬圓筒（外徑22mm、內(nèi)徑20mm、長(zhǎng)70mm）上纏繞5 圈，承受重量2kg，施加寬2.4cm、厚1mm 的橡膠止血帶。將大鼠腹面向上舉起，其腳通過(guò)金屬圓筒落下。通過(guò)將止血帶推到大鼠大腿上來(lái)誘導(dǎo)后肢壓迫一段時(shí)間后，通過(guò)切割和取下止血帶解除壓迫。止血帶拉力等同于3kg 重物的壓力，5h 后撤除止血夾恢復(fù)擠壓肢體血流灌注，其間大鼠能自由獲取食物與水。

1.5 藥物干預(yù)

空白組（B 組）除腹腔予5% 戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020240）麻醉外無(wú)任何處理、對(duì)照組（C 組）擠壓肢體前無(wú)藥物干預(yù)、氯化鈉組（NS 組）擠壓肢體前30min 予10ml/kg 生理鹽水和褪黑素組（MT 組）擠壓肢體前30min 予10ml/kg 褪黑素溶液，給藥方式均通過(guò)大鼠尾靜脈5min 內(nèi)推注。

1.6 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試

水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試即學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)試，于術(shù)前、術(shù)后1～5d 測(cè)試，時(shí)間定為每天上午9 點(diǎn)，根據(jù)測(cè)定方法進(jìn)行[11]，測(cè)試儀自動(dòng)得出逃避潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)以及目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。

1.7 TNF-α、IL-10 水平檢測(cè)

術(shù)前、術(shù)后1d、3d、5d 采集尾靜脈血1ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定TNF-α、IL-10 水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 組大鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均無(wú)死亡，均未見(jiàn)麻醉相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生。4 組游泳速度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明無(wú)疼痛等干擾水迷宮測(cè)試結(jié)果。

通過(guò)方差分析定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，各組潛伏期逐漸縮短，說(shuō)明認(rèn)知能力逐漸恢復(fù)中。除空白組及褪黑素組術(shù)后5d 外，與術(shù)前1d 比較，其他5 個(gè)時(shí)點(diǎn)潛伏期均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），與空白組比較，其他3 組潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），與對(duì)照組比較，褪黑素組的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），與氯化鈉組比較，褪黑素組的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組潛伏期比較（）

表1 各組潛伏期比較（）

注：與術(shù)前1d 比較，*P＜0.001；與B 組比較，#P＜0.001；與C 組比較，ΔP＜0.05；與NS 組比較，▲P＜0.05

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

定位航行實(shí)驗(yàn)包括目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)，通過(guò)記錄120s 內(nèi)在目標(biāo)象限探索時(shí)間和準(zhǔn)確穿越平臺(tái)的次數(shù)，算出目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比，其反映實(shí)驗(yàn)對(duì)象的記憶功能。百分比越低，穿越平臺(tái)次數(shù)越少，記憶功能越差。第6 天空間探索實(shí)驗(yàn)軌跡直觀地顯示了大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限（第3 象限）停留時(shí)間，見(jiàn)表2、表3。

與空白組比較，對(duì)照組和氯化鈉組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.001），與對(duì)照組比較，褪黑素組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P＜0.01），與氯化鈉組比較，褪黑素組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 穿越平臺(tái)次數(shù)與目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比（）

表2 穿越平臺(tái)次數(shù)與目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比（）

注：與B 組比較，*P ＜0.001；與C 組比較，#P ＜0.05，與NS 組比較，ΔP＜0.05

與空白組比較，對(duì)照組和氯化鈉組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比顯著減少（P＜0.001），與對(duì)照組比較，褪黑素組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比顯著增加（P＜0.01），與氯化鈉組比較，褪黑素組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)表2。

與B 組比較，MT 組趨向性較好，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C 組和NS 組相對(duì)穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間較B 組和MT 組少。

2.3 炎癥因子水平

2.3.1 血清IL-10 水平的變化 與術(shù)前1d 比較，對(duì)照組、氯化鈉組、褪黑素組術(shù)后1、3、5d IL-10 水平顯著升高（P＜0.05）；與空白組比較，其他3 組術(shù)后1、3、5d IL-10 水平顯著升高（P＜0.001）；與對(duì)照組比較，褪黑素組IL-10 水平顯著降低（P＜0.05）；與氯化鈉組比較，褪黑素組IL-10 水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 大鼠各時(shí)點(diǎn)血清IL-10 水平比較（，pg/ml）

表3 大鼠各時(shí)點(diǎn)血清IL-10 水平比較（，pg/ml）

注：與術(shù)前1d 比較，*P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.001；與C 組比較，ΔP＜0.05；與NS 組比較，▲P＜0.05

2.3.2 血清TNF-α 水平的變化 與術(shù)前1d 比較，對(duì)照組、氯化鈉組、褪黑素組術(shù)后1、3、5d TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與空白組比較，其他3 組術(shù)后1、3、5d TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001）；與對(duì)照組比較，褪黑素組 TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05）；與氯化鈉組比較，褪黑素組TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 大鼠各時(shí)點(diǎn)TNF-α 水平比較（，pg/ml）

表4 大鼠各時(shí)點(diǎn)TNF-α 水平比較（，pg/ml）

注：與術(shù)前1d 比較，*P＜0.001；與B 組比較，#P＜0.001；與C 組比較，ΔP＜0.05；與NS 組比較，▲P＜0.05

3 討論

POCD 的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，但研究證實(shí)，炎癥因子可以影響POCD 的發(fā)生[11]。雌激素具有抗炎作用，缺血再灌注、麻醉和應(yīng)激反應(yīng)引起圍術(shù)期非特異性炎性反應(yīng)，POCD 患者血漿IL-6、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、TNF-α 等水平均高于未發(fā)生POCD 的水平[12]。

本研究對(duì)老年大鼠骨骼肌進(jìn)行缺血再灌注造模[7]，此種造模引起炎癥相關(guān)細(xì)胞的激活和機(jī)體炎性反應(yīng)狀態(tài)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多重影響，導(dǎo)致神經(jīng)功能和神經(jīng)膠質(zhì)平衡的變化[13,14]。缺血再灌注與外周器官組織損傷引起神經(jīng)炎癥造成海馬區(qū)受損，是圍術(shù)期老年患者認(rèn)知障礙的關(guān)鍵因素[15]。本實(shí)驗(yàn)選擇水迷宮測(cè)試大鼠空間探索來(lái)檢測(cè)其認(rèn)知功能，首先術(shù)前排除不會(huì)游泳的老年大鼠，著重從行為學(xué)、炎癥介質(zhì)變化等方面進(jìn)行觀察。本研究選擇褪黑素，因其具有抗氧化、抗炎活性[16-17]，近年來(lái)，褪黑素在缺血再灌注損傷相關(guān)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用，其具有對(duì)缺血再灌注局部及遠(yuǎn)隔器官損傷的保護(hù)作用[18,19]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，褪黑素的這種保護(hù)作用與抑制氧自由基釋放、中性粒細(xì)胞的激活及炎性細(xì)胞因子的大量釋放密切相關(guān)，進(jìn)而保護(hù)遠(yuǎn)隔器官[20]。同時(shí)，缺血再灌注誘發(fā)全身炎性反應(yīng)，可以導(dǎo)致神經(jīng)元損傷進(jìn)而出現(xiàn)認(rèn)知功能的減退，故認(rèn)為褪黑素可以通過(guò)抑制炎性反應(yīng)，抑制氧自由基的釋放，減輕神經(jīng)元的損傷從而降低認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率。

本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果表明，4 組大鼠術(shù)后的游泳速度無(wú)顯著差異（游泳速度是用來(lái)評(píng)判疼痛程度及運(yùn)動(dòng)功能障礙引起的潛伏期改變），表明術(shù)后疼痛沒(méi)有干擾水迷宮的測(cè)試結(jié)果。與空白組比較，其他3組潛伏期顯著延長(zhǎng)，說(shuō)明造模對(duì)大鼠術(shù)后行為及認(rèn)知功能具有一定影響；與對(duì)照組和氯化鈉組比較，褪黑素組的潛伏期顯著縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比顯著增加、術(shù)后1、3、5d TNF-α、IL-10 水平明顯降低，說(shuō)明褪黑素可以明顯降低炎性反應(yīng)水平，通過(guò)抑制炎性反應(yīng)，抑制氧自由基的釋放，減輕神經(jīng)元的損傷從而降低認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素預(yù)處理能夠抑制炎癥反應(yīng)，減輕炎癥因子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，降低術(shù)后POCD 的發(fā)生，更有利于提高患者的術(shù)后生存狀態(tài)和生活質(zhì)量。

綜上所述，褪黑素預(yù)處理能夠減少老年大鼠骨骼肌缺血再灌注后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率，降低應(yīng)激炎性反應(yīng)，提高術(shù)后生存質(zhì)量。