重組新城疫病毒載體疫苗研究進展

王 芳，楚富茗，王秋霞*，盧 浪，蔡 暢，張 新，李文霞，裴大偉，劉興友,2*

(1.河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.厚德食品股份有限公司，吉林遼源 136200)

近年來，各類人畜共患傳染病和由野生動物傳播的新病已經(jīng)嚴重威脅到動物和人類的生存與發(fā)展。高效、安全疫苗的開發(fā)和研制對于新發(fā)、再發(fā)和穩(wěn)定傳染病的防控具有重要意義。目前獸醫(yī)領域使用的疫苗主要是減毒活疫苗和滅活疫苗。這些疫苗顯著降低了一些重大疾病對畜禽生產(chǎn)的危害，為畜牧業(yè)發(fā)展提供了保障。但隨著畜禽養(yǎng)殖水平的發(fā)展、疫病防控形勢的變化，這些疫苗也顯現(xiàn)出缺陷與不足。減毒活疫苗通常比較有效，可以誘導細胞免疫和體液免疫反應，其疫苗毒株通常是通過篩選天然弱毒及人工傳代致弱獲得，這也意味著疫苗毒株研制具有不確定性，研發(fā)周期較長，并且致弱毒株存在毒力返強的風險[1]。滅活疫苗通常比較安全[2]，但是不能誘導機體產(chǎn)生細胞免疫，可能不如減毒疫苗有效，且其接種劑量大，成本較高。因此，迫切需要開發(fā)一種新型疫苗來改變現(xiàn)狀。

隨著反向遺傳學技術的廣泛應用[3]，許多病毒被開發(fā)用作病毒載體制備新型疫苗。最初的病毒載體多來自脫氧核糖核酸(DNA)病毒，例如皰疹病毒[4]、痘病毒[5]和腺病毒[6]等。目前，隨著反向遺傳學方法的不斷成熟，許多核糖核酸(RNA)病毒，包括正鏈RNA病毒(小核糖核酸病毒、冠狀病毒和黃病毒)和負鏈RNA病毒(副黏病毒和正黏病毒)，已被操縱用作疫苗載體[7]。在這些RNA病毒中，新城疫病毒(NDV)是一種感染禽類的副黏病毒，因其特有的優(yōu)勢受到眾多學者的關注，已經(jīng)作為一種重要的疫苗載體[8]，用于開發(fā)針對家禽重要病原體的雙價疫苗。

NDV用作疫苗載體具有獨特的優(yōu)勢[9]，NDV比較穩(wěn)定，可通過飲水、噴霧等途徑進行群體免疫；表達外源基因的NDV載體可以激發(fā)廣泛的保護性免疫反應，包括體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫；NDV不容易感染其他動物，具有較好的安全性；NDV能在雞胚中良好復制，適合大規(guī)模批量生產(chǎn)；將NDV致弱后，插入其他病毒的保護性抗原基因，可以達到一苗防多病的效果[10]，這些特性使得NDV成為一種合適的病毒載體。但是，作為一種RNA病毒弱毒載體，NDV具有毒力返強或快速變異的可能性，從而造成不容小覷的損失，因此，在改造或選擇插入位點時需綜合考慮這些問題。為了給NDV載體疫苗研究提供有用的參考，本文對NDV載體疫苗研究的最新進展以及此類疫苗在動物和人類醫(yī)學中的潛在用途進行了綜述。

1 NDV生物學特征

NDV是副黏病毒科副黏病毒屬成員。NDV病毒粒子呈多形性，大多是球形，直徑為100 nm[11]。病毒的基因組共編碼6種結構蛋白和2種非結構蛋白，這6種結構蛋白，按3′-NP(核衣殼蛋白)-P(磷蛋白)-M(基質(zhì)蛋白)-F(融合蛋白)-HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白)-L(大蛋白)-5′排列[11]，其中P基因通過RNA編輯可編碼2種非結構蛋白V、W蛋白。NDV的NP、P和L蛋白與病毒基因組共同形成核糖核蛋白(RNP)復合體，該復合體是病毒具有感染活性的最小單位，在細胞中可有效啟動病毒基因的復制與轉錄，為NDV反向遺傳操作系統(tǒng)的建立提供了重要的理論依據(jù)[12]。

NDV基因組由連接序列分隔，連接序列由3個保守的轉錄控制元件組成，分別為基因起始(GS)、基因間(IG)和基因末端(GE)信號序列。在6個主要基因產(chǎn)生mRNA之前直接轉錄GS信號(3′-UGCCCAUCUU-5′)，然后在GE信號(3′-AUUCUUUUUU-5′)處被加帽、甲基化和終止。IG區(qū)位于GE和GS序列之間，長度可變(1～47個核苷酸)，主要參與前一個基因轉錄的終止和后一個基因轉錄的啟動。因此，被插入到NDV GS和GE信號側翼的外源基因可以被表達[13]。這使得操縱NDV基因組作為載體來傳遞和表達用于疫苗接種和基因治療的外源基因成為可能。

2 NDV載體外源基因的插入方式

傳統(tǒng)的添加外源基因的方式，就是在其兩側添加適當?shù)霓D錄起始和終止信號，這些信號被病毒RNA依賴性RNA聚合酶識別，從而啟動基因的轉錄。NDV與其它非節(jié)段負鏈RNA病毒有著相同的轉錄和復制模式，從病毒基因組的3′近端到5′遠端，每個下游基因的轉錄水平是低于其上游的，這也是基因相對于NDV基因組的位置，其mRNA豐富度呈現(xiàn)梯度的原因。所以，將外源基因插入NDV基因組3′端時，其表達水平最高，但對病毒自身的復制有較大影響，若將外源基因插入NDV基因組5′端，雖然對病毒自身的復制能力較小，但外源基因的表達量也低[15]。因此，在構建重組病毒載體時需要綜合考慮插入位點和外源基因的表達量之間的平衡。通過反向遺傳技術將綠色熒光蛋白基因(GFP)分別插入到NDV VG/GA基因組的五個不同基因間區(qū)域，然后對重組病毒的致病性，生長動力學和GFP的表達情況進行評估，結果表明，將GFP插入在P和M基因之間時，重組新城疫病毒載體(rNDV)整個復制過程中綠色熒光蛋白強度最高，延遲最低[14]。

外源基因的另一種插入方式是通過內(nèi)部核苷酸切入位點(IRES)，它可以允許從單個mRNA轉錄物中表達2個基因。將內(nèi)部核苷酸切入位點紅色熒光蛋白(IRES-RFP)插入到重組新城疫弱毒株rLa Sota (NDV rLa Sota)載體的NP、P、M、F、HN及L基因內(nèi)部(終止密碼子之后，GE之前)，成功構建了一系列外源基因插入位置不同的rNDV[15]。分析這些重組病毒的組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)、雞胚半數(shù)致死量(EID50)、雞胚平均死亡時間(MDT)等生物學特性指標得出，所有重組病毒都表現(xiàn)出了與親本LoSota毒株相似的復制能力及生長動力學特性；然后分別從蛋白水平和轉錄水平檢測rNDV RFP的表達情況，結果證實了NDV mRNA轉錄量是按照基因組3′至5′的順序逐次遞減[16]，且當IRES-RFP插入到NP基因內(nèi)部時，其外源基因的表達量最高。當需要高表達量的外源基因時，可以直接將IRES插入到NP基因的下游，然后再插入目的基因。另一方面，如果外源基因是用于癌癥免疫治療的促炎細胞因子，則IRES和外源基因可以插入到M基因的下游，使其表達適度以避免細胞因子風暴?？偠灾肐RES攜帶外源基因，插入NDV基因組基因尾部的這一新插入方式也為以后重組病毒的構建提供了新的思路。

還有一種方式是通過整合轉錄單位來表達NDV病毒載體的外源基因。通過反向遺傳技術成功拯救了無毒的NDV毒株TS09-C，然后將GFP基因插入到TS09-C的NP、P、M基因起始密碼子的上游，中間以可自切割的口蹄疫病毒2A肽和泛素基因相連，通過2A肽在體內(nèi)的自切割活性進行翻譯后分離，而且未增加基因組的轉錄框數(shù)量，因此對病毒自身的復制沒有造成影響，結果表明當GFP基因插入到TS09-C的M基因上游時，外源基因的表達量最高[17]。與傳統(tǒng)的單獨轉錄系統(tǒng)相比，這種方式顯示出較高的表達效率。

3 NDV載體在新型疫苗研究中的應用

3.1 NDV在人用活載體疫苗中的應用

NDV作為人用疫苗載體，其安全性是最為重要的。在各種動物模型和人體臨床測試中也證實了NDV對人類是無致病性、相對安全、無副作用的[18]。更為重要的是，人類副黏病毒及其他病毒預先存在的免疫力和母體抗體通常不會干擾NDV的復制。因此，以NDV作為人用疫苗載體是安全的。到目前為止，已有許多關于以NDV為病毒載體的人用疫苗研究報道，如新型冠狀病毒、日本腦炎病毒、埃博拉病毒[19-21]等疫苗。

急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)可以引起急性呼吸道傳染病，從2019年至今SARS-CoV-2引起的史無前例的2019年冠狀病毒病(COVID-19)大流行已導致數(shù)億人感染，數(shù)百萬人死亡，并繼續(xù)對公眾健康構成威脅。有研究拯救了表達兩種形式SARS-CoV-2刺突蛋白S的NDV載體，即野生型(WT)S和SF嵌合體型(包含NDV F跨膜結構域和細胞質(zhì)結構域)[19]。S和SF作為NDV的外源基因都能很好的表達，用3種表達S蛋白的NDV載體疫苗(NDV-LS-S、NDV-LS-S-F和NDV-LS/L289A-S-F)在小鼠試驗中都可以誘導高滴度的中和抗體，3種COVID-19候選疫苗株都完全保護小鼠免受SARS-CoV-2適應株的攻擊，攻毒后的第4天在小鼠肺部都沒有檢測到病毒和病毒抗原。不管是表達野生型還是嵌合型的rNDV候選疫苗株都可作為抵抗COVID-19的活疫苗，SF嵌合型重組體還表現(xiàn)出與NDV優(yōu)異的整合能力，有被用作滅活疫苗的潛力。

日本腦炎病毒(JEV)是一種蚊媒病毒，是造成急性腦炎綜合征的重要原因。JEV的免疫原性蛋白包膜(E)和非結構蛋白1(NS1)被廣泛用于開發(fā)針對JEV的疫苗。將rNDV-Ejev和rNDV-NS1jev鼻內(nèi)接種Balb/c小鼠，小鼠產(chǎn)生了針對NDV和JEV的有效中和抗體，并且在收集的鼻腔和泄殖腔拭子中未檢測到任何病毒，這也證明NDV不會水平傳播，作為疫苗載體很安全[20]。檢測小鼠細胞因子，與模擬感染組相比，rNDV組中抗炎因子水平顯著升高，說明所有重組疫苗都激發(fā)了Th1和Th2介導的細胞免疫反應。但是與rNDV-NS1jev相比，rNDV-Ejev免疫效果更好。表明rNDV-Ejev是一種有前途的抗JEV感染的病毒載體活疫苗，或許是替代現(xiàn)有疫苗的一種經(jīng)濟策略。

埃博拉病毒(EBOV)是一種能引起人類和其他靈長類動物產(chǎn)生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒，但目前還沒有理想的疫苗。先前也有學者對人類副流感病毒3型 (HPIV-3)疫苗載體進行了評估，雖然能誘導機體產(chǎn)生保護性免疫反應，但人群對HPIV-3有預先存在的抗體，限制了病毒載體的復制能力，此外，HPIV-3疫苗載體免疫效率低下，安全性也令人擔憂。在最新研究中，為了使NDV BC株對靈長類動物具有免疫原性且對禽類不致病，將NDV BC株的F和HN基因的胞外域替換為APMV-3株的相對應胞外域，構建了能夠高效表達EBOV糖蛋白GP的rNDV-3FHN N/P-GP[21]。對豚鼠進行rNDV-3FHN N/P-GP疫苗免疫，ELISA檢測感染豚鼠血清中IgG抗體滴度，第1次免疫后35 d，感染rNDV-3FHN N/P-GP動物的IgG抗體滴度高達1∶57 600。通過鼻拭子樣本中檢測IgA滴度進一步研究了豚鼠的黏膜免疫反應，rNDV-3FHN N/P-GP免疫組檢出高水平的IgA，且至少持續(xù)到第1次免疫后的42 d。rNDV-3FHN N/P-GP在豚鼠中激發(fā)了體液和黏膜免疫反應，是非常具有潛力的EBOV載體疫苗，同時也克服了其他副黏病毒載體存在的缺點。NDV有些毒株天然具有溶解腫瘤細胞的潛力[22]，能夠內(nèi)在地觸發(fā)腫瘤細胞裂解和誘導腫瘤細胞免疫原性細胞死亡(ICD)，這已經(jīng)在臨床上得到證實，所以NDV在癌癥的治療上也是很有前景的。

樹突狀細胞(DC)是人體內(nèi)抗原遞呈能力最強的細胞，細胞炎癥蛋白-3α(MIP-3α)是DC的特異性趨化因子。在NDV的P和M之間插入MIP-3αcDNA構建rNDV-MIP3α作為體內(nèi)DC疫苗，用于放大抗腫瘤免疫效應[23]。蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測上清液和血清中的MIP-3α，高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、血清IgG和腺苷三磷酸(ATP)；Transwell室檢測DCs的趨化性，流式細胞術分析DC的表型；免疫熒光和免疫組織化學觀察DC的胞外鈣網(wǎng)蛋白(CRT)和瘤內(nèi)吸引力；再用脾細胞和抗體的過繼轉移以及T細胞亞群的消耗來評估抗腫瘤免疫與T細胞亞型作用之間的關系。研究結果表明，NDV-MIP3α具有與野生型NDV(NDV-WT)幾乎相同的腫瘤細胞溶解能力。感染NDV-MIP3α的小鼠黑色素瘤細胞(B16)和小鼠結腸癌細胞(CT26)均能強烈促進DC成熟和活化。與NDV-WT相比，腫瘤內(nèi)注射NDV-MIP3α和小鼠體內(nèi)注射NDV-MIP3α的T淋巴細胞的過繼轉移都顯著抑制了B16和CT26腫瘤的生長。在注射NDV-MIP3α的小鼠中發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境顯著逆轉。與NDV-WT相比，rNDV-MIP3α作為體內(nèi)DC疫苗通過誘導更強的系統(tǒng)免疫和調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來增強抗腫瘤活性。以上的試驗結果不僅證明了NDV-MIP3α的溶瘤能力，而且無需離體操作注射NDV-MIP3α就能顯著抑制腫瘤的生長。當前的癌癥治療方法主要依賴手術、化療和放射療法，但傳統(tǒng)的治療手段有很大的副作用，且預后效果較差，溶瘤療法是一種具有巨大潛力的新方法，此項研究或許能為以后的癌癥治療提供有價值的參考。

3.2 NDV載體疫苗在獸用活載體疫苗中的應用

NDV載體疫苗的可行性已經(jīng)在雞、羊、小鼠、豬、狗等物種中進行了評估[24]。NDV減毒活疫苗在世界各地廣泛使用，使NDV成為家禽病原體的天然疫苗載體，插入另一種禽病原體保護性抗原即可用作雙價疫苗。傳染性支氣管炎(IB)和新城疫(ND)是威脅家禽業(yè)的兩大傳染病，疫苗接種是控制疾病的最佳方法。但由于病毒的重組和變異導致新的血清型已經(jīng)出現(xiàn)，這兩種病原體仍然是國內(nèi)家禽生產(chǎn)的重要威脅。因此，開發(fā)針對IBV和NDV的二價疫苗還是備受關注的熱點。通過反向遺傳技術成功的拯救了表達IBV S1的重組La Sota候選疫苗株 rNDV-IBV-T/B。106EID50的劑量對1日齡的百來亨雞進行疫苗接種，在3周齡時用強毒IBV M41進行攻毒，rNDV-IBV-T/B保護率達到了90%[25]。rNDV-IBV-T/B 疫苗接種組和La Sota疫苗接種組的纖毛停滯評分分別為4.2和37.6，這表明rNDV-IBV-T/B疫苗接種降低了IBV對氣管的致病性。此外，實時熒光定量PCR結果顯示，在攻毒后的四天中，rNDV-IBV-T/B疫苗接種組的病毒載量顯著低于La Sota組和對照組。同時，相同接種劑量的rNDV-IBV-T/B對強毒NDV F48E9的攻擊的保護效率達到100%。這些結果表明，rNDV-IBV-T/B 是同時控制IB和ND的有希望的候選疫苗。

H5N1亞型高致病性禽流感病毒(HPAIV)是世界范圍內(nèi)重要的家禽經(jīng)濟病原體，從禽類到人類的傳播也對公共健康造成一定的威脅。盡管滅活疫苗已被普遍使用，但對于禽類H5N1 AIV的暴發(fā)仍未得到有效控制。以NDV TS09-C毒株為病毒載體，構建了表達HPAIV H5N1不同形式血凝素(HA)的rNDV[26]。重組rTS-HA、rTS-HA1和rTS-tPAs/HA1分別表達HA、HA1和具有組織纖溶酶原激活劑信號序列(tPAs)的HA1蛋白。106TCID50的劑量對小雞和小鼠進行免疫，然后在二次免疫的2周進行強毒攻擊，動物試驗結果表明，使用rNDV進行免疫接種可以激發(fā)有效的H5N1 AIV和NDV特異性抗體反應，并對雞和小鼠致死性H5N1 AIV和NDV攻擊提供免疫保護。更重要的是，接種rTS-tPAs/HA1可增強雞和小鼠的保護性免疫反應，這與tPAs可以促進HA1蛋白的表達和分泌息息相關。該研究提供了一種NDV疫苗載體研究的新思路，可以表達可溶形式的異源病毒蛋白，這將極大地幫助我國家禽業(yè)的發(fā)展。

由于家禽與其他物種巨大的種屬差異，其他物種一般不感染家禽的傳染病，因此，NDV載體除用于家禽病原體的疫苗載體外，也廣泛應用于牛、羊、犬、豬等家畜活載體疫苗的研究中。裂谷熱病毒(RVFV)是一種由蚊子傳播的布尼亞病毒，可感染反芻動物(牛和羊)，給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，并對非洲和阿拉伯半島的公共衛(wèi)生產(chǎn)生重大影響。雖然減毒活疫苗具有高度免疫原性，但它們在牲畜中的使用并不安全。滅活疫苗比減毒活疫苗安全性好，但效果較差，需要重復接種。為了提高疫苗的免疫原性和安全性，有研究開發(fā)了一種表達RVFV的Gn和Gc糖蛋白的NDV載體疫苗(NDFL-GnGc)[27]。用NDFL-GnGc疫苗(107.3TCID50/劑)對羔羊進行2次接種，都激發(fā)了高滴度的RVFV特異性中和抗體。

狂犬病是由狂犬病病毒(RV)引起的的一種人獸共患病，可導致人類和動物致命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。為了生產(chǎn)有效、安全且價格合理的狂犬病疫苗，對表達狂犬病病毒糖蛋白G的 NDV毒株R2B進行了評估。以NDV R2B為病毒載體，構建兩種表達RV糖蛋白G的活載體疫苗NDV-R2B-RVG和rNDV-R2B-FPCS，其中rNDV-R2B-FPCS是改變了R2B F蛋白的裂解位點[28]。這兩種候選疫苗毒株在小鼠實驗模型中都誘導產(chǎn)生了強大的體液免疫和細胞免疫反應，與NDV-R2B-RVG相比，rNDV-R2B-FPCS誘導產(chǎn)生的細胞免疫反應水平更高。

NDV作為家禽和家畜活疫苗載體的潛力已被證明，rNDV還可用作病毒感染的間接ELISA檢測試劑盒，已經(jīng)在豬瘟(CSF)上證明了其可行性[29]。CSF是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種重要的家豬和野豬病毒性疾病。CSFV的E2和E1是具有免疫原性的結構蛋白，參與病毒與宿主細胞表面的附著及隨后的侵入。因此，E2和E1蛋白被用于診斷和開發(fā)針對CSFV感染的疫苗。構建表達CSFV的E2和E1蛋白的rNDV，在細胞和雞胚中表達和回收病毒[29]。將回收的rNDV在豬鼻內(nèi)接種，表達E2和E1蛋白的rNDV誘導接種豬產(chǎn)生了CSFV中和抗體，并且從接種動物中采集的血清可以中和同源和異源CSFV毒株。此外，表達CSFV的E2和E1蛋白的rNDV還可用于開發(fā)間接ELISA檢測試劑盒，用于檢測隨機收集的血清樣品的抗體效價。表明rNDV表達的E2和E1蛋白的ELISA試劑盒可用于篩查CSFV感染。

4 展望

隨著反向遺傳學技術的出現(xiàn)，rNDV載體疫苗被廣泛用于疫苗接種，也為開發(fā)有效的重組疫苗提供了機會。我國每年接種超過300億劑表達HPAIV H5N1 HA基因(rLa Sota/H5N1-HA)的rNDV減毒活疫苗。雖然通過飲水或噴霧進行免疫在一定程度上阻止了NDV和HPAIV H5N1的傳播和流行，但由于其基因型與流行的NDV毒株不匹配，并沒有阻止強毒NDV傳染。因此，從NDV毒株中提取的rNDV疫苗載體能更有效地控制NDV。

對于家禽來說，預先存在的母源抗體(MDA)可能會損害病毒載體的復制，導致針對外來抗原的免疫反應效率低下。要提高NDV載體疫苗的有效性，需避免母體抗體(MDA)的干擾。有研究提出了規(guī)避MDA干擾的見解[30]，用非來自NDV克隆30基因組的禽副黏病毒8型(APMV-8)的F和 HN蛋白構建了一種NDV的嵌合載體，然后在F和HN基因之間插入HPAIV H5基因，獲得重組病毒chNDVFHN PMV8H5。通過蛋白質(zhì)印跡和電子顯微鏡證實異源蛋白的表達和病毒粒子的摻入，且新產(chǎn)生的重組病毒在雞胚中的復制能力與親代NDV相當。接種ChNDVFHN PMV8H5可完全保護雞免受致死性HPAIV感染，并且在感染動物體內(nèi)沒有檢測到MDA的存在。

相反，由于缺乏預先存在的NDV特異性抗體，NDV載體疫苗可作為免疫接種哺乳動物和人類重要傳染病的一種選擇。特別是在人類新發(fā)傳染病的情況下，如H7N9亞型禽流感和COVID-19，NDV載體疫苗可以作為緊急疫苗接種的替代品，因為在實驗室構建rNDV速度快，并且可以通過滴眼或鼻內(nèi)噴霧途徑進行免疫，既方便又省時。過去20年的研究證明了NDV作為疫苗載體的潛力，未來NDV載體有望取得更大的研究進展。