TNF-α在食管鱗癌細胞中對PD-L1表達的影響

朱世茂,李惠武,楊銀銀,海妮薩依姆·圖爾蓀,王永晨,李 卉

(1新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室,烏魯木齊 830011;2粵北人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心;3新疆醫(yī)科大學中心實驗室;*通訊作者,E-mail:huihui922@126.com)

食管癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一,全球食管癌發(fā)病率和死亡率分別位居第7位和第6位[1]。目前食管癌的診斷和治療手段雖有很大改進,但由于早期食管癌缺乏特異性癥狀,多數(shù)食管癌患者就診時已經(jīng)處于中晚期,且總體預后差,5年生存率僅為5%～10%[2]。隨著醫(yī)學研究的發(fā)展和深入,免疫療法已成為治療癌癥的一種效策略[3]。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種多效性細胞因子,在免疫穩(wěn)態(tài)、炎癥和宿主防御中起核心作用。根據(jù)細胞環(huán)境,它可以誘導多種效應,如凋亡、壞死、免疫細胞激活等,在腫瘤免疫監(jiān)測中具有重要意義。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要作用,它表現(xiàn)出促腫瘤和抗腫瘤的雙重效應[4]。程序性細胞死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)及其受體PD-1是重要免疫檢查點分子,正常情況下下,PD-L1與其受體PD-1結合后可抑制T細胞的過度增殖活化,維持機體正常的免疫平衡[5]。在腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中PD-L1的異常高表達可介導腫瘤免疫逃逸,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關,是抗腫瘤治療的重要熱點[6]?，F(xiàn)有研究表明,TNF-α可在包括脊索瘤在內的多種腫瘤細胞中誘導PD-L1表達升高[7],而在食管癌中的研究卻少有報道。

因此,鑒于細胞因子TNF-α在腫瘤中特殊作用,高表達的PD-L1能夠介導腫瘤免疫逃逸,本文旨在研究TNF-α在食管鱗癌細胞株Eca109中能否調節(jié)PD-L1的表達,以及可能的分子調控機制,并為食管癌的干預治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

食管鱗癌細胞系Eca109細胞(細胞株購買于武漢普諾賽生命科技有限公司,本實驗室培養(yǎng)保存),RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶細胞消化液、磷酸緩沖鹽溶液購自以色列Biological Industry公司,磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑購自美國Thermo公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司;兔抗人PD-L1抗體、兔抗人PKA抗體購自美國Abcam公司;兔抗人P-CREB抗體購自美國Cell Signaling Technology公司、TNF-α細胞誘導因子購自美國peprotech公司;Staurosporine抑制劑購自美國Selleck公司;反轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自中國大連TaKaRa公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 人食管鱗癌細胞系Eca109復蘇后接種于含10%胎牛血清和含青/鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2條件的恒溫細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48 h換液一次,待培養(yǎng)細胞貼壁70%以上時按實驗需求進行細胞傳代。將實驗分為空白對照組、TNF-α組和TNF-α+Staurosporine組。Staurosporine是一種蛋白酶抑制劑,可抑制PKA。其中TNF-α和Staurosporine這兩種物質的工作濃度均為20 ng/ml。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測PD-L1 mRNA的表達 采用Trizol法提取細胞總RNA并測定RNA的純度和濃度。按照逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA,放置于-20 ℃保存。上海生工公司合成所需引物。PD-L1引物如下,F:5′-CCTACTGGCATTTGCTGAACGCAT-3′;R:5′-ACCATAGCTGATCATGCAGCGGTA-3′;以β-actin作為內參,F:5′-GAGCACAGAGCCTCGTT-3′;R:5′-GAGCGCGGCGATATCATCA-3′,PCR擴增,進行結果分析。

1.2.3 免疫熒光染色檢測PD-L1的蛋白表達 取對數(shù)生長期的Eca109細胞,消化成懸液后接種于6孔板內的玻璃爬片上,待細胞貼壁后,用濃度為20 ng/ml的TNF-α誘導24 h,以未做處理的細胞作為對照組。加入磷酸緩沖鹽溶液清洗并棄掉洗液,用4%多聚甲醛室溫固定15 min后用磷酸緩沖鹽溶液清洗3次,每次10 min。兔抗人PD-L1(1 ∶200)室溫、黑色濕盒封閉1 h,然后洗滌3次,每次10 min。使用熒光二抗室溫、黑色濕盒孵育1 h,然后洗滌3次,每次10 min;然后加入Hochest熒光染料進行細胞核染色。最后在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察并采集圖片。

1.2.4 Western blot檢測PD-L1、p-CREB和PKA的蛋白表達 采用RIPA裂解液充分裂解細胞進行細胞總蛋白的提取,BCA法進行總蛋白濃度的測定。將總蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離并轉移至PVDF膜上,單克隆抗體一抗(5% BSA稀釋,稀釋比例1 ∶1 000),4 ℃搖床過夜。然后PBST洗去一抗,孵育二抗(5% BSA稀釋,山羊抗兔1 ∶5 000,山羊抗鼠1 ∶20 000)室溫1 h。洗滌之后用ECL顯影試劑顯色。Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩組間比用獨立樣本t檢驗,多組間比用單因素方差分析。以P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α對Eca109細胞PD-L1 mRNA表達的影響

結果顯示,使用TNF-α作用細胞24 h后,與空白對照組比較,PD-L1 mRNA表達升高(P<0.05,見圖1);與TNF-α組相比,TNF-α+Staurosporine組PD-L1 mRNA水平降低(P<0.05,見圖1)。

2.2 TNF-α對Eca109細胞PD-L1蛋白表達的影響

結果顯示,與空白對照組比較,TNF-α組使用TNF-α作用細胞24 h后激光共聚焦鏡下觀察PD-L1(圖中紅色光點)的數(shù)量明顯增多(見圖2),PD-L1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05,見圖3),Western blot結果與免疫熒光染色結果一致。

2.3 抑制PKA通路抑制TNF-α誘導的Eca109細胞PD-L1蛋白表達

結果顯示,與空白對照組相比,TNF-α組中PD-L1的蛋白表達水平增高(P<0.05,見圖4),p-CREB和PKA蛋白表達無明顯差異(P>0.05,見圖4);與TNF-α組比較,在聯(lián)合使用TNF-α和Staurosporine后,TNFα+Staurosporine組中PD-L1、P-CREB和PKA的蛋白表達水平降低(P<0.05,見圖4)。

3 討論

食管癌是世界范圍內最致命的惡性腫瘤之一。它的兩種主要組織病理學分型是食管鱗狀細胞癌和腺癌,這兩種亞型的發(fā)病率因地理區(qū)域而異:食管鱗狀細胞癌在東亞、東部和南部非洲以及南歐的患病率較高,而腺癌在北美和歐洲地區(qū)更為常見[8],全球范圍內的食管鱗狀細胞癌約占食管癌病例的80%以上[9]。食管癌的發(fā)病原因尚不清楚,通常認為與遺傳因素、環(huán)境因素和飲食習慣等有密切關系[10],因此,在食管癌中揭示疾病的分子機制,并為食管癌的干預治療提供理論依據(jù)尤為重要。

細胞因子對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有不可逆的改變作用,其中TNF-α主要是由白細胞特別是巨噬細胞分泌的一種具有多種生物學效應的細胞因子[11],其已被證明可以在多種癌細胞中誘導 PD-L1的表達水平的升高,如卵巢癌、肝癌、胰腺癌等[12-14],且PD-L1的升高與癌癥患者的不良預后相關。為了探究TNF-α是否能夠在食管癌細胞中誘導 PD-L1的表達,本研究中利用食管鱗狀細胞癌細胞株Eca109細胞為研究對象,通過PCR、Western blot和免疫熒光實驗方法檢測,發(fā)現(xiàn)單獨使用TNF-α誘導Eca109細胞時可以促進PD-L1的表達升高,表明TNF-α參與PD-L1上調過程。但是TNF-α調節(jié)Eca109細胞PD-L1表達升高的途徑需要進一步研究。

免疫檢查點阻斷治療是目前應用最廣泛的腫瘤免疫治療方法之一。PD-L1及其受體PD-1信號通路是一個已經(jīng)被用于多種癌癥臨床治療的免疫檢查點[15]。在多種類型的腫瘤中針對PD-L1或PD-1的腫瘤免疫治療已被證明是有效的,具有持久、毒性較小的抗腫瘤免疫反應[6]。免疫逃逸是腫瘤的一個標志,也是影響腫瘤臨床治療效果的主要原因。腫瘤細胞可表達多種免疫抑制信號蛋白,導致免疫細胞功能障礙和凋亡,其中一個抑制分子是PD-L1[16]。在腫瘤發(fā)生時,PD-L1與PD-1結合可阻止T細胞的活化和增殖,負性調節(jié)免疫應答,導致腫瘤細胞免疫逃逸的發(fā)生,當阻斷PD-L1/PD-1時可以重新激活細胞毒性T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。腫瘤中PD-L1的表達受不同因素的影響,主要包括信號通路、轉錄因子及表觀遺傳調控,翻譯機翻譯后修飾調控等[17]。有研究結果表明[18]當抑制蛋白激酶A(PKA)時,在彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞株中cAMP通過PKA-CREB通路誘導PD-L1表達升高的作用被逆轉。本研究中Eca109細胞經(jīng)誘導處理后,通過熒光定量PCR和Western blot實驗方法檢測結果表明,TNF-α聯(lián)合Staurosporine處理Eca109細胞后可降低PD-L1 mRNA的表達,同時PD-L1、p-CREB和PKA的蛋白表達也降低,逆轉了TNF-α上調PD-L1表達的作用,說明TNF-α促PD-L1的表達可能與PKA-CREB信號通路有關,但是具體的調控機制需要進一步的實驗驗證。

綜上所述,本文研究了細胞因子TNF-α對PD-L1表達的影響以及相關途徑的探討,發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠促進食管鱗癌細胞Eca109細胞PD-L1的表達,而且TNF-α上調PD-L1表達作用可能與PKA-CREB信號通路有關,加深對TNF-α誘導PD-L1表達過程的理解,有助于為探尋食管癌的治療靶點提供理論參考。