脂溢性角化病造模方法研究進(jìn)展

李佳惠 馬 樅 佟 立

內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，通遼，028000

脂溢性角化病(seborrheic keratosis，SK)又稱為基底細(xì)胞乳頭瘤、老年斑，是常見的皮膚良性腫瘤，國內(nèi)研究顯示SK發(fā)病年齡高峰為51～79歲[1]。SK可以發(fā)生于除黏膜、手掌和足底之外的任何皮膚部位[2]。目前認(rèn)為SK發(fā)病的危險因素包括紫外線暴露、年齡、免疫異常等[3]。隨著人們對皮膚健康重視程度的提高，脂溢性角化病在皮膚科門診越來越常見。目前常用的治療方案為液氮冷凍、激光和手術(shù)等，費(fèi)用較高，且如果后續(xù)護(hù)理不當(dāng)可能出現(xiàn)炎癥后色素沉著[3]。

鑒于SK的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療方式局限，因此建立重復(fù)性高、穩(wěn)定性好的SK模型對深入研究病因、發(fā)病機(jī)制、治療及有效預(yù)防具有重要意義。目前SK模型可分為動物模型和細(xì)胞模型，研究者大多從SK機(jī)制出發(fā)或在研究相關(guān)疾病中發(fā)現(xiàn)SK皮損。本文就目前國內(nèi)外SK模型建立的進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對每種造模方法進(jìn)行評價，以期為模型選擇提供依據(jù)。

1 動物模型

1.1 基因工程SK小鼠模型 基因工程動物模型是近年來常用的造模方法，通過導(dǎo)入外源目的基因或基因敲除的方式進(jìn)行造模。一般只涉及單個基因。

1.1.1 成纖維細(xì)胞生長因子受體3突變的小鼠模型 成纖維細(xì)胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3)是酪氨酸激酶受體(FGFR1-4)中的一種，參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、遷移，傷口愈合和血管生成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。FGFR3突變是SK中最常見的致癌基因突變[5]。2005年Logié等[4]在對FGFR3致癌作用的研究中，構(gòu)建攜帶S249C位點(diǎn)突變的FGFR3載體，再將此載體注射到B6D2F1小鼠的受精卵中。隨后出生的7只小鼠中有4只在皮膚上表達(dá)了突變的FGFR3基因，3只出現(xiàn)了皮膚表型，這3只小鼠的后代也遺傳了突變基因并且在3～4個月齡時眼瞼、鼻部出現(xiàn)疣狀腫瘤，后續(xù)出現(xiàn)軀干部皮膚增厚并伴有毛發(fā)脫落。皮損的組織學(xué)檢查與脂溢性角化病相似。

該研究是首次在FGFR3突變的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炑芯恐邪l(fā)現(xiàn)SK皮損，證實了FGFR3突變與SK發(fā)病的關(guān)系，并為酪氨酸激酶靶向藥物治療提供可能性。然而，F(xiàn)GFR3突變是否能直接誘導(dǎo)SK發(fā)病尚存爭議。有研究者通過靶向基因重組方法構(gòu)建FGFR3突變的小鼠用于研究軟骨發(fā)育不全[6]，在這些小鼠中并沒有出現(xiàn)皮膚病變，研究者推測該突變可能受到小鼠遺傳背景、FGFR3在皮膚表達(dá)的數(shù)量以及FGFR3突變的啟動子在小鼠和人類之間存在差異的影響[4]。還有研究者認(rèn)為FGFR3的突變可以導(dǎo)致皮膚增生，但不足以導(dǎo)致皮膚的良性或惡性腫瘤[7]。這些研究說明該方法直接誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)SK存在不穩(wěn)定性，F(xiàn)GFR3突變與SK發(fā)病之間可能存在其他推動因素。因此該方法建立SK模型在理論和實踐上還需要繼續(xù)的討論。值得關(guān)注的是，F(xiàn)GFR3突變激活下游叉頭框蛋白1可能與SK保持良性增殖和凋亡抑制有關(guān)[8]。研究者可以以此為思路繼續(xù)探究致癌基因FGFR3突變與SK發(fā)病以及保持腫瘤良性性狀之間的關(guān)系。

1.1.2 早老蛋白1部分缺失的小鼠模型 早老蛋白(presenilins ,PSs)是γ-分泌酶復(fù)合體的活性中心，參與切割淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)羧基末端片段，與年齡相關(guān)疾病阿爾茲海默癥的發(fā)病有關(guān)[9]。其中早老蛋白1(presenilin1，PS1)在γ-分泌酶復(fù)合體相關(guān)途徑中占主導(dǎo)作用[10]。2004年Tournoy等[11]研究PSs功能受損的后果，同時為了避免全部敲除PSs基因型PS1/PS2-的胚胎致死性，故部分敲除PS1基因得到PS1+/-PS2-/-基因型的小鼠，具體方法不詳，結(jié)果觀察到75%(25/33)的小鼠在6～18個月齡時生殖器周和口周出現(xiàn)疣狀突起和皮膚糜爛，主要位于生殖器周和口周，經(jīng)過組織學(xué)檢查與人類的SK極為相似。有的小鼠還出現(xiàn)了不同程度的頸部腫脹等免疫異常表現(xiàn)。

這次研究首次證明了SK的發(fā)病與PS1部分缺失存在聯(lián)系，也提出了與年齡相關(guān)的發(fā)病因素。2018年，有研究發(fā)現(xiàn)PS1的下游蛋白APP在SK皮損中表達(dá)高于正常皮膚，尤其見于紫外線暴露部位[12]。2021年牟婧淳等[9]等研究發(fā)現(xiàn)PS1的mRNA水平在SK皮損中明顯低于鄰近正常皮膚組織(P<0.001)，再次證實了PS1以及APP與SK發(fā)病相關(guān)。2014年Watanabe等[13]在研究早老蛋白部分缺失對大腦皮層神經(jīng)元活動的影響時，條件性敲除PS1得到不同程度的PS2小鼠，研究者沒有闡明小鼠皮膚的病變，因此PS1的部分缺失似乎與SK的發(fā)病關(guān)系更大。但是由于此后并沒有學(xué)者重復(fù)該方法研究SK，因此該方法造模仍存在偶然性，研究者可根據(jù)此思路設(shè)計模型，探究PS1和SK發(fā)病的具體機(jī)制，進(jìn)一步提高模型的穩(wěn)定性。

1.2 紫外線誘發(fā)SK小鼠模型 與人類相關(guān)的紫外線(Ultraviolet，UV)由長波紫外線UVA和中波紫外線UVB組成[14]。目前UVA、UVB均有誘導(dǎo)出SK的相關(guān)報道。

1.2.1 UVA照射誘導(dǎo)SK小鼠模型 2011年Ming等人[15]利用15 J/cm2的UVA照射抑癌基因PTEN下調(diào)的小鼠來研究PTEN在UVA誘導(dǎo)的皮膚腫瘤中發(fā)揮的作用。37周時PTEN+/-小鼠出現(xiàn)了皮膚腫瘤，其中67%的皮膚腫瘤為SK，33%為鱗狀細(xì)胞癌。此方法誘導(dǎo)的SK小鼠可進(jìn)一步用于病因機(jī)制方面的研究，但是由于同時出現(xiàn)了鱗狀細(xì)胞癌小鼠，說明此方法的結(jié)果存在不確定性，或許與小鼠在實驗中很難接受相同紫外線照射時間有關(guān)，而且此方法實驗周期長，操作較復(fù)雜，不適合大量復(fù)制和進(jìn)行短期內(nèi)研究。

1.2.2 UVB照射誘導(dǎo)SK小鼠模型 2009年，Haw[16]等利用UVB照射12周齡的無毛白化Skh：HR-1小鼠來研究聚谷氨酸(γ-PGA)的抗腫瘤作用，12周后發(fā)現(xiàn)小鼠皮損中最常見的皮膚病變?yōu)橹缧越腔?。這是首次對UVB誘導(dǎo)出SK進(jìn)行報道的文章。但是研究者在文獻(xiàn)中沒有明確UVB的照射劑量及時間，因此實驗缺乏可重復(fù)性。2012年Saeed等[17]為研究UVB照射對小鼠表皮中的表皮生長因子受體(EGFR)的影響，利用波長為312 nm的UVB照射4周齡BALB/c小鼠，暴露組照射20 min/天，每周5天，共3個月。3個月后在暴露組小鼠皮損的病理檢查中發(fā)現(xiàn)了常見的棘皮型SK，同時發(fā)現(xiàn)暴露組小鼠表皮的EGFR表達(dá)明顯升高。這次研究再次說明UVB照射可以成功誘導(dǎo)脂溢性角化病，并且明確了UVB的輻照劑量和輻照時間，探索了SK相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，還證實了抗氧化劑有減緩SK發(fā)病的作用。2016年Saeed等[18]再次利用UVB照射3～4周齡BALB/c小鼠(方法同上)，來研究防曬霜對SK的預(yù)防作用。這次在暴露組中又一次成功誘導(dǎo)出SK小鼠。

以上研究說明長期慢性UVB照射誘導(dǎo)SK小鼠模型成功率高，并且操作簡單，易于大量復(fù)制，便于對發(fā)病機(jī)制展開研究，尤其是疾病預(yù)防方面可以提供重要的幫助。然而UVB照射皮膚誘導(dǎo)的損傷取決于許多變量，包括波長、劑量、種族和皮膚組織特征[19]，想要建立與人類皮膚組織相似性高的SK模型，要求研究者對實驗動物的挑選和紫外線劑量等方面進(jìn)行嚴(yán)格控制。

2020年，Cheong等[20]發(fā)現(xiàn)暴露于紫外線部位的SK皮損中鳥嘌呤脫氨酶(guanine deaminase，GDA)高于正常皮膚，進(jìn)一步研究了紫外線反復(fù)暴露下的角質(zhì)形成細(xì)胞中GDA以及下游尿酸的表達(dá)，二者均升高，研究者推測鳥嘌呤脫氨酶以及下游尿酸上調(diào)可以產(chǎn)生活性氧導(dǎo)致DNA損傷，加速紫外線暴露下的SK細(xì)胞的衰老。這也說明SK細(xì)胞中或許存在與活性氧相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷。是否是紫外線造成的SK細(xì)胞中GDA升高和活性氧的產(chǎn)生有待研究。研究者可以以此為依據(jù)進(jìn)行SK機(jī)制和模型的探索。

1.3 異種移植SK裸鼠模型 異種移植模型是指將患者的皮損移植到免疫缺陷的小鼠身上，是常見的造模方法。2012年，陳明等[21]將來自患者的SK組織塊成功移植在BALB/c裸鼠背部。組織病理學(xué)檢查顯示皮損保留了人SK的組織特性。移植皮損存活最長時間為30天，平均21天。成功率75%。

該方法通過SK皮損移植，建立了與人類皮損相似的SK裸鼠模型，成功率高，適用于短期內(nèi)活體研究SK的發(fā)病機(jī)制、評價SK藥物療效以及藥物研發(fā)。但是，此類動物模型對移植物供體要求較高，制作移植皮損需要大量SK患者提供供體，不同供體之間存在遺傳異質(zhì)性，不適合大量復(fù)制研究。

2 細(xì)胞模型

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)模型 原代細(xì)胞培養(yǎng)模型可以保留疾病組織源特性，常用的方法有組織塊法、酶消化法、機(jī)械法。

2.1.1 黑素相關(guān)原代細(xì)胞模型 2013年Takenaka等[22]研究內(nèi)皮素1和干細(xì)胞因子在脂溢性角化病的黑素細(xì)胞活化中的作用時，建立了SK原代細(xì)胞模型。研究者將SK組織滅菌、磷酸鹽緩沖液沖洗后在0.1%的胰蛋白酶中37℃處理1小時，將SK組織分散成單個細(xì)胞。后700 g離心5分鐘分離SK細(xì)胞，置于加入表皮生長因子和牛腦垂體提取物的154S培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共進(jìn)行了3次傳代。

該方法成功培養(yǎng)了SK原代細(xì)胞模型，并進(jìn)行了后續(xù)內(nèi)皮素1和干細(xì)胞因子與SK細(xì)胞黑素形成的關(guān)系的一系列實驗，為細(xì)胞模型的建立提供思路。此次實驗中選取的SK皮損均為棘皮型和黑棘皮瘤型，其他病理類型是否能成功復(fù)制該方法還不清楚。而且本實驗僅進(jìn)行了3次傳代，可能無法進(jìn)行大量的實驗研究。

2.1.2 蛋白激酶B通路相關(guān)原代細(xì)胞模型 蛋白激酶B又稱Akt激酶，SK中常見的FGFR3突變和磷脂酰肌醇3激酶突變都可以激活A(yù)kt[23]。2016年Neel等[23]在研究SK中的Akt通路時，構(gòu)建了SK細(xì)胞模型。研究者將SK皮損放入不含鈣、鎂的磷酸鹽緩沖液中保存，后經(jīng)過洗滌、消化，用鑷子將皮損分離成小塊，放入0.25%胰蛋白酶中消化組織分離細(xì)胞。1000 r/min離心5分鐘，離心后重懸在含有適量MycoZap Plus-PR的角質(zhì)形成細(xì)胞中，使用膠原蛋白覆蓋平板，每天更換培養(yǎng)基。研究者稱此方法可以至少傳3代。

這次實驗成功建立了SK細(xì)胞培養(yǎng)模型，并且進(jìn)一步研究了Akt通路的持續(xù)激活與SK之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了Akt抑制劑和野生型P53對SK凋亡的作用，為Akt抑制劑對SK的治療提供思路。但是后續(xù)沒有類似研究證明此方法的可重復(fù)性。

3 小結(jié)

本文總結(jié)了目前國內(nèi)外脂溢性角化病造模的方法。很多研究者根據(jù)SK的發(fā)病機(jī)制建立模型，其中轉(zhuǎn)基因動物模型證據(jù)不足，紫外線誘導(dǎo)和異種移植模型較為可靠，然而紫外線誘導(dǎo)的模型成功的具體機(jī)制還不清楚，紫外線是SK發(fā)病的直接誘導(dǎo)因素還是間接誘導(dǎo)因素還有待研究。由于細(xì)胞模型具有實驗?zāi)康膯我?，可控性?qiáng)，便于觀察等特點(diǎn)是其他模型不可替代的，而目前SK只有原代培養(yǎng)模型可供參考，因此今后SK細(xì)胞模型可以作為研究者攻克方向。此外，研究者可以采用多因素聯(lián)合培養(yǎng)對造模方法進(jìn)行改良。綜上，研究者可根據(jù)自己的研究方向選擇合適的造模方法。