干細胞與生物起搏的研究進展

陳雅婷，張建成，李 泱

目前，對于病態(tài)竇房結(jié)綜合征等嚴(yán)重緩慢性心律失常的治療策略主要是植入人工心臟起搏器，通過人工產(chǎn)生的電脈沖來控制心臟的跳動。雖然拯救了無數(shù)病人的生命并提高了其生命質(zhì)量，但仍存在一些缺點和局限性，包括感染、金屬過敏、電極脫位、電子干擾和缺乏神經(jīng)激素反應(yīng)性。因此，“心臟生物起搏”已成為探究緩慢性心律失常治療的新方向。本研究結(jié)合近年來國內(nèi)外最新文獻報道，對干細胞與生物起搏的研究進展進行綜述。

1 干細胞的研究現(xiàn)狀與進展

心臟生物起搏是指利用細胞分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)，對機體受損的自律性節(jié)律點或特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)的細胞進行修復(fù)或替代，從而構(gòu)建“生物起搏器”，得以恢復(fù)心臟的起搏和傳導(dǎo)功能，并從心臟生理功能和人體適應(yīng)性的角度，避免了傳統(tǒng)電子起搏器的缺陷和嚴(yán)重并發(fā)癥，是邁向基于自體干細胞更理想的療法[1]。心臟生物起搏器的構(gòu)建是今后的重要發(fā)展方向，其基礎(chǔ)和關(guān)鍵是找到理想的種子細胞。目前，用于構(gòu)建心臟生物起搏的細胞主要為干細胞：包括胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。為了能夠從干細胞中分離獲得更多、更純的起搏樣細胞，大量研究聚焦于轉(zhuǎn)化因子促進干細胞向起搏樣細胞的誘導(dǎo)分化和階段性調(diào)控相關(guān)竇房結(jié)發(fā)育生物學(xué)信號級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)干細胞分化為起搏樣細胞。

2 干細胞與生物起搏

2.1 ESCs與生物起搏 ESCs作為原始胚胎中的一類細胞，具有多向分化、無限增殖且自我更新的特性[2]。當(dāng)ESCs誘導(dǎo)分化為具有起搏功能的心肌細胞時，有效地提高ESCs衍生心肌細胞的總產(chǎn)量和富集純的心肌細胞變得尤為重要。ESCs來源的心肌樣細胞一般是從胚狀體中跳動區(qū)域分離得到的，這些早期的心肌細胞具有起搏細胞的特性，可作為構(gòu)建生物起搏器的種子細胞，但這些細胞的數(shù)量少、純度不理想。為了能夠從ESCs中分離獲得更多、更純的起搏樣細胞，ESCs誘導(dǎo)分化的研究陸續(xù)展開。

2.1.1 ESCs分化與轉(zhuǎn)化因子 為了能夠從ESCs中分離獲得更多、更純的起搏細胞，大量研究聚焦于操縱Shox2、Tbx、HCN等轉(zhuǎn)錄因子及起搏基因的表達來促進ESCs向起搏樣細胞的誘導(dǎo)分化。Ionta等[3]直接將Shox2基因轉(zhuǎn)染至小鼠ESCs(mESCs)，誘導(dǎo)分化獲得起搏樣細胞并成功構(gòu)建了生物起搏器。Scavone等[4]研究發(fā)現(xiàn)，ESCs中CD166+的細胞可發(fā)育為竇房結(jié)樣細胞，這些細胞可高表達參與竇房結(jié)細胞發(fā)育的相關(guān)基因Tbx18、Tbx3、Isl-1和Shox2等，以及相關(guān)功能基因Cx30.2、HCN4、HCN1、CaV1.3等，并低表達心室肌基因Cx43、Kv4.2、HCN2、Nkx2.5，且與小鼠的竇房結(jié)細胞形態(tài)相似并具有起搏特性，與新生大鼠心室肌細胞共培養(yǎng)表現(xiàn)出更快的跳動頻率，這揭示了CD166+可作為篩選竇房結(jié)樣細胞的重要細胞外標(biāo)志蛋白。Hoffmann等[5]在此研究基礎(chǔ)上，為了驗證竇房結(jié)細胞中Shox2依賴性的發(fā)育機制，通過5種不同的竇房結(jié)樣細胞誘導(dǎo)方案，從分離出Shox2+CD166+和Shox2-CD166+竇房結(jié)樣細胞中發(fā)現(xiàn)，Shox2+CD166+竇房結(jié)樣細胞表達有更多的竇房結(jié)標(biāo)志基因，表明僅以CD166+作為有效富集純化竇房結(jié)樣細胞的標(biāo)記仍有不足，且目前尚未有CD166+ESCs的在體動物研究結(jié)果，值得進一步的探究。Jung等[6]將人Tbx3和Myh6啟動子相結(jié)合構(gòu)建穩(wěn)定的組成型Tbx3過表達mESCs，其衍生的心肌細胞聚集體中>80%在蛋白質(zhì)表達和電生理參數(shù)上具有起搏器表型所需的功能特征，且每分鐘的搏動頻率達300～400次。Saito等[7]將兔HCN4基因轉(zhuǎn)染至小鼠ESCs，誘導(dǎo)分化為mESC-CMs，產(chǎn)生快速的自發(fā)搏動和起搏電流，且對起搏電流抑制劑伊伐布雷定和激動劑異丙腎上腺素有生物反應(yīng)性，在體外與其他可興奮細胞共培養(yǎng)具有同步收縮起搏能力，可用于生物起搏器的構(gòu)建。

2.1.2 ESCs分化與發(fā)育生物學(xué)信號通路的調(diào)控 研究表明，通過調(diào)控竇房結(jié)發(fā)育生物學(xué)的相關(guān)信號通路來誘導(dǎo)ESCs分化為竇房結(jié)樣細胞。Zhu等[8]通過調(diào)控NRG-1β/ErbB信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)hESC-CMs分化培養(yǎng)物中的竇房結(jié)樣細胞與工作型心肌細胞的比例，發(fā)現(xiàn)NRG-1β/ErbB信號的抑制可增加具有竇房結(jié)樣細胞的比例，同時降低工作型心肌細胞。Birket等[9]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)ESCs分化為心肌細胞過程中，可分為Nkx2.5陽性表達(Nkx2.5+)的工作心肌細胞和Nkx2.5陰性表達(Nkx2.5-)的竇房結(jié)樣起搏細胞，后者表達高水平竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)基因及起搏離子通道基因，電生理檢測記錄到竇房結(jié)細胞樣的動作電位及起搏電流，當(dāng)培養(yǎng)到30 d，Nkx2.5-細胞群依然保持著起搏細胞的特征和搏動頻率。Protze等[10]通過骨形成蛋白-4(BMP4)、視黃酸(RA)和成纖維細胞生長因子抑制劑(FGFi)的序貫誘導(dǎo)提高Nkx2.5-hESCs的比例，且在Nkx2.5-hESCs中記錄到舒張期去極化的動作電位，起搏電流If、ICa，T、Ik，ATP，其對β受體激動劑和抑制劑具有良好的生物反應(yīng)性，將富集到的Nkx2.5-hESCs移植到大鼠的左室心尖部，能夠成功起搏用藥物誘導(dǎo)出房室傳導(dǎo)阻滯的心臟，并用Optical mapping技術(shù)記錄到起搏點源于移植部。Liang等[11]通過添加激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)的外源性Wnt3a配體，可增加起搏器樣心肌細胞的產(chǎn)量，起搏器表型伴隨著竇房結(jié)樣細胞的特異性基因和基因產(chǎn)物的表達而增強，同時減少肌鈣蛋白T(cTnT)陽性心肌分化，此結(jié)果表明Wnt/β-catenin途徑是ESCs分化過程中心肌亞型發(fā)生的關(guān)鍵決定因素：內(nèi)源性Wnt信號傳導(dǎo)的激活有利于起搏器譜系的表達，而其抑制則促進了室性心肌細胞譜系。此外，研究表明，蘇拉明、內(nèi)皮素-1和鈣激活的鉀通道可促進胚胎干細胞誘導(dǎo)分化為竇房結(jié)樣細胞，竇房結(jié)特異性標(biāo)志物表達水平顯著上調(diào)[12-15]。

關(guān)于ESCs的研究證實了ESCs可以誘導(dǎo)分化為起搏樣心肌細胞，并用于心臟生物起搏器的構(gòu)建，但這些細胞始終存在倫理學(xué)的問題，且免疫原性、成瘤性問題也一直受到關(guān)注。此外，精確調(diào)控ESCs定向誘導(dǎo)分化、純化等問題尚需解決。

2.2 MSCs MSCs是一種非造血的基質(zhì)細胞，根據(jù)來源主要分為骨髓間充質(zhì)干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，具有自我更新和多向分化潛能，且獲取相對容易，可取自病人自身，不存在組織相容性問題，適宜自體移植等優(yōu)點，成為生物起搏的種子細胞。然而，MSCs不具有電生理活性但表達縫隙連接蛋白，向起搏細胞的分化相對困難，更多的研究將MSCs作為一種目的基因的載體，通過轉(zhuǎn)染起搏基因或調(diào)控竇房結(jié)分化的轉(zhuǎn)錄因子可獲得起搏樣細胞，與周圍心肌形成電偶聯(lián)發(fā)揮生物起搏功能[16]。

2.2.1 MSCs分化與起搏基因 早期研究多轉(zhuǎn)染單個起搏基因構(gòu)建生物起搏器，Cheng等[17]將小鼠的HCN4轉(zhuǎn)染至犬間充質(zhì)干細胞(cMSCs)，從而產(chǎn)生Cs+敏感的起搏電流，將所轉(zhuǎn)染的3×106cMSCs注射至右心室心外膜下，發(fā)現(xiàn)注射部位自發(fā)產(chǎn)生心室節(jié)律，搏動頻率為(45±9)次/min，表明基因修飾的cMSCs可以在體外和體內(nèi)表達功能性HCN4離子通道，作為心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)重要的起搏基因。Darche等[18]將起搏HCN4轉(zhuǎn)導(dǎo)入人類BMSCs和ADSCs并與新生大鼠心室肌細胞共培養(yǎng)以促進起搏樣細胞的誘導(dǎo)分化，2周后，轉(zhuǎn)染的人類ADSCs表現(xiàn)出更早的自發(fā)性收縮和更快的搏動速率且具有規(guī)律性和同步性，同時產(chǎn)生具有心臟起搏器組織特征的離子通道(CaV1.2，NCX1)、轉(zhuǎn)錄因子(Tbx3，Tbx18，Shox2)和縫隙連接蛋白(Cx31.9，Cx45)。Wei等[19]用同樣的方法獲得竇房結(jié)樣細胞，在Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯模型犬左室前壁進行注射，連續(xù)6周觀察后發(fā)現(xiàn)，起源于移植部位的平均自主節(jié)律[(59±5)次/min]較未移植對照組[(38±2)次/min]明顯上升，且具有心律變異性。但是，隨著時間的推移，源自移植部位的自主節(jié)律開始逐漸下降。究其原因，可能與移植細胞的凋亡、流失或未能與周圍心肌細胞形成良好的電機械偶聯(lián)有關(guān)。Yang等[20]用攜帶小鼠鈣激活鉀通道的SK4基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)ADSCs，體外培養(yǎng)5～7 d后將轉(zhuǎn)導(dǎo)的ADSCs植入大鼠左心室游離壁，2周后，在離體的灌流大鼠心臟中建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯，移植部位產(chǎn)生了異位節(jié)律并承擔(dān)了生物起搏器的

功能；同時，SK4在ADSCs中的穩(wěn)定地表達促進ADSCs的分化，Shox2和HCN4的表達上調(diào)，產(chǎn)生起搏電流且可被CsCl所抑制，以及誘導(dǎo)了p-ERK1/2和p-p38 MAPK的表達。這揭示了p38-MAPK和ERK1/2信號通路的激活可促進起搏樣細胞的誘導(dǎo)分化，為心臟生物起搏器的構(gòu)建提供了新思路。

2.2.2 MSCs分化與轉(zhuǎn)錄因子 近年來的研究聚焦于轉(zhuǎn)染竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可促進BMSCs或ADSCs向竇房結(jié)樣細胞誘導(dǎo)分化，竇房結(jié)特異性標(biāo)志物表達增加并產(chǎn)生起搏電流。張健等[21]將過表達胰島素基因增強子結(jié)合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein-1，ISL-1)的ADSCs與乳鼠心室肌細胞共培養(yǎng)7 d促進起搏樣細胞的誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)竇房結(jié)特異性基因表達上調(diào)，同時工作心肌特異性基因表達下調(diào)，且大多數(shù)細胞可記錄到起搏電流，表明ADSCs經(jīng)單一轉(zhuǎn)錄因子ISL-1的基因修飾可在體外心肌微環(huán)境中，誘導(dǎo)產(chǎn)生竇房結(jié)樣細胞。Feng等[22]將Shox2轉(zhuǎn)染至犬BMSCs并與乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)7 d以上，誘導(dǎo)分化為起搏樣細胞，高表達起搏基因Tbx3、HCN4、Cx45，而低表達心室基因Nkx2.5和Cx43，且可在體外快速起搏乳鼠心室肌細胞。Hu等[23]將Tbx18轉(zhuǎn)染至豬BMSCs促進起搏樣細胞的誘導(dǎo)分化，細胞形態(tài)由紡錘形變化為條帶狀，在第10天，約7%的BMSCs-Tbx18中觀察到了搏動，搏動頻率約為90次/min，并且該搏動可以在體外持續(xù)約3周，同時Tbx18、肌鈣蛋白I(cTnI)、HCN4、α-SA的表達增加，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSCs植入豬右心室并成功起搏竇房結(jié)功能障礙的心臟，且對β-腎上腺素能激動劑有反應(yīng)性。Zhang等[24]通過將轉(zhuǎn)錄因子的組合(ISL-1和 Tbx18)共同轉(zhuǎn)染脂肪干細胞，再與新生大鼠心室肌細胞體外共培養(yǎng)7 d后，誘導(dǎo)ADSC成功分化為起搏樣細胞。更多的研究在體外證實，通過多種方法將Tbx18轉(zhuǎn)染至BMSCs或ADSCs可促進其向竇房結(jié)樣細胞誘導(dǎo)分化，竇房結(jié)特異性標(biāo)志物表達增加并產(chǎn)生起搏電流。由于BMSCs和ADSCs不具有電生理活性，本身并不具備起搏細胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，鑒于竇房結(jié)電生理特征的復(fù)雜性，單一的導(dǎo)入起搏基因所構(gòu)建的起搏樣細胞特性與竇房結(jié)細胞仍有明顯的差異，但要更加接近生理性的竇房結(jié)細胞功能，需要轉(zhuǎn)導(dǎo)大量的離子通道基因和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，這是很大的工程，難以付諸實踐。

2.3 iPSCs iPSCs是通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞。2007年Takahashi等[25]通過4種特定轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的轉(zhuǎn)染將人皮膚成纖維細胞重編程為iPSCs，自此揭開了人體細胞重編程的帷幕，也迅速成為干細胞領(lǐng)域的研究熱點。iPSCs獲得方法相對簡單并且穩(wěn)定，可取自自體細胞，不需要使用卵細胞或者胚胎，跨越了細胞移植所帶來的免疫排斥、倫理爭議等問題。此外，iPSCs在形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)志物及端粒酶活性等方面與ESCs具有相似性，且在多種轉(zhuǎn)化方法的應(yīng)用下，可大大降低非定向分化導(dǎo)致的致瘤性。這些特性使iPSCs相較于成體干細胞移植，能夠更好地整合到宿主心臟組織中。

Mandel等[26]對誘導(dǎo)iPSCs來源的心肌細胞(iPSC-CMs)進行連續(xù)15 d的觀察記錄，發(fā)現(xiàn)其搏動頻率非常穩(wěn)定，具有一定的節(jié)律變異性，對乙酰膽堿和β-腎上腺素刺激存在生物反應(yīng)性，但起搏頻率僅為30～50次/min，表明iPSC-CMs具有一定的起搏功能。Chauveau等[27]首次使用源自人的iPSC-CMs創(chuàng)造了一種生物起搏器，將40～75個由自發(fā)搏動的iPSC-CMs組成的節(jié)律收縮的胚狀體注射到左心室，在完全性心臟傳導(dǎo)阻滯犬模型中可以在體內(nèi)與心室肌整合，從而構(gòu)建心臟生物起搏器，但iPSC-CMs心臟起搏器的速度和節(jié)奏仍有待優(yōu)化。

研究表明，不同的誘導(dǎo)方法獲得的iPSC-CMs的搏動頻率也不盡相同；同時也有研究表明，在干細胞衍生的心肌中，存在著一些細胞具有竇房結(jié)細胞的特征，但這種細胞的比例較少，甚至是一過性的[28]。因此，尋找新的誘導(dǎo)方法促進iPSCs分化為高表達竇房結(jié)特異性基因、高純度且具有起搏功能的竇房結(jié)樣細胞，已成為構(gòu)建生物起搏器亟須解決的問題。

2.3.1 iPSCs分化與轉(zhuǎn)錄因子 胚胎期的轉(zhuǎn)錄因子能夠從竇房結(jié)發(fā)育的上游信號通路調(diào)控細胞的發(fā)育，導(dǎo)入竇房結(jié)細胞轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控iPSCs更多地向竇房結(jié)樣細胞分化。王蕓等[29-30]分別將Tbx18用不同的方式轉(zhuǎn)染至hiPSC-CMs促使其向起搏樣細胞誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)起搏特異性基因HCN4表達上調(diào)，心室肌特異性基因如鈉電流(SCN5A，INa)、內(nèi)向整流鉀電流(Kir2.1，IK1)、CX43表達下調(diào)，從而表明Tbx18基因的傳遞具有開發(fā)生物起搏的潛力，能夠促進hiPSC-CMs分化為起搏樣細胞。Zhao等[31]將Tbx3和HCN2共同轉(zhuǎn)染hiPSC-CMs以重編程為起搏樣心肌細胞，工作型心肌細胞特異性標(biāo)志CX40、CX43、SCN5A、Kir2.1的表達下調(diào)，而竇房結(jié)細胞特異性標(biāo)志CX30.2和CX45的表達增加，并產(chǎn)生竇房結(jié)細胞樣的動作電位和起搏電流。Tbx3和HCN2的共表達促使舒張期最大

去極化電位以及起搏電流的產(chǎn)生，其協(xié)同作用產(chǎn)生起搏細胞的最典型特征——自發(fā)性舒張期去極化，為構(gòu)建生物起搏器提供新策略。Gorabi等[32]將Tbx18轉(zhuǎn)染的hiPSC-CM產(chǎn)生的起搏樣細胞注射到大鼠的左心室前外側(cè)壁，進行心臟離體實驗構(gòu)建完全性心臟傳導(dǎo)阻滯后，心率顯著增加、心室纖顫持續(xù)時間較少，且上調(diào)HCN4表達及下調(diào)Cx43表達，故通過細胞和基因治療策略導(dǎo)入Tbx18基因后，可證明功能性起搏器的形成。

2.3.2 iPSCs分化與發(fā)育生物學(xué)信號通路的調(diào)控 Protze等[10]通過對發(fā)育信號通路的階段性調(diào)控，誘導(dǎo)人多能干細胞分化為竇房結(jié)樣起搏細胞，該研究基于Nkx2.5表達與否將心肌細胞進行分類，結(jié)果顯示Nkx2.5-的細胞可高表達竇房結(jié)細胞特異性標(biāo)志物，并可記錄到起搏電流，將其移植至房室傳導(dǎo)阻滯模型大鼠的心尖部位，可有效起搏心臟周圍的組織，進而證明其具有生物起搏功能。通過該方法誘導(dǎo)的起搏樣細胞數(shù)量多、純度高，為iPSCs成功構(gòu)建生物起搏提供了新的借鑒，但生物起搏的效果需要進行大型動物的相關(guān)研究。Ren等[33]揭示經(jīng)典的Wnt信號傳導(dǎo)在指導(dǎo)中胚層細胞命運決定的基因調(diào)控上發(fā)揮作用，促使起搏細胞的分化。在斑馬魚中，起搏器心肌細胞衍生自Nkx2.5+中胚層的一個子集，該子集對典型Wnt5b信號做出響應(yīng)以啟動心臟起搏器程序，包括心臟起搏器細胞分化轉(zhuǎn)錄因子Isl-1和Tbx18的激活以及Nkx2.5的沉默。通過發(fā)現(xiàn)起搏器心肌細胞的起源，揭示了進化上保守的Wnt信號傳導(dǎo)機制，該機制協(xié)調(diào)了指導(dǎo)中胚層細胞命運決定的基因調(diào)控變化，從而導(dǎo)致起搏器心肌細胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)通過小分子抑制劑CHIR99021處理，在分化的第5天能重新激活心臟祖細胞經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)，可促進TNT2起搏樣心肌細胞的分化且起搏特異性基因表達增加，表明Wnt5b信號在體外可促進hiPSC起搏樣心肌細胞的誘導(dǎo)分化，為心臟生物起搏治療提供了潛在的策略。與此同時，雖然此研究與協(xié)同操縱的多個信號通路誘導(dǎo)起搏樣細胞的研究不同，但在心臟發(fā)育過程中重新激活經(jīng)典的Wnt信號傳導(dǎo)，可能通過協(xié)調(diào)階段性的信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)來介導(dǎo)心臟起搏器細胞的發(fā)育，該信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)可能包括BMP信號傳導(dǎo)和其他信號傳導(dǎo)途徑(FGF和RA)指導(dǎo)心臟祖細胞趨向于心臟起搏器的命運，且抑制了它們分化為其他心肌細胞類型[10]。

3 小 結(jié)

心臟生物起搏器的構(gòu)建可通過轉(zhuǎn)化因子和竇房結(jié)發(fā)育生物學(xué)信號級聯(lián)的調(diào)控等方式促進干細胞向竇房結(jié)樣細胞誘導(dǎo)分化，作為病態(tài)竇房結(jié)綜合征及Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯等嚴(yán)重緩慢性心律失常一種新型的細胞治療手段，具有獨特的優(yōu)勢。如今，起搏樣細胞的誘導(dǎo)分化仍困難重重，探索路程漫長而任重道遠。但是，生物起搏器替代電子起搏器仍是未來的發(fā)展方向，相信在不遠的將來，通過不斷的實驗研究，心臟生物起搏器可以安全有效地應(yīng)用于緩慢型心律失常病人的臨床治療當(dāng)中，為人類帶來福音。