腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

白永軍，張令霖，連新福

缺血性腦卒中是一種具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率特點(diǎn)的常見(jiàn)腦血管疾病，而痰瘀互結(jié)證是缺血性腦卒中的常見(jiàn)中醫(yī)類型之一[1-2]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是疾病生理病理研究的重要載體，是醫(yī)藥衛(wèi)生發(fā)展的不可或缺的支撐條件。早在1984年國(guó)際腦血管病委員會(huì)就曾提出，缺血性腦卒中的研究應(yīng)以局部腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜑檠芯繉?duì)象，并對(duì)該模型的制作方法提出了明確要求[3]。根據(jù)中醫(yī)學(xué)病證結(jié)合的診療理念，制作成功的腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型對(duì)缺血性腦卒中的研究具有重要意義。本研究從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、造模方法的選擇、線栓的選擇、進(jìn)線深度、再灌注時(shí)間、中醫(yī)證型的建立等多個(gè)方面對(duì)腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型制作方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

目前，在人類疾病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠、小鼠、犬、猴、家兔等為較常用的模型動(dòng)物。但由于腦血管疾病研究的特殊性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇有所局限。猴雖具有和人類非常相近的高級(jí)神經(jīng)中樞，但由于研究成本高昂，不利于開(kāi)展大樣本的重復(fù)性研究；家兔的大腦皮層、神經(jīng)血管發(fā)育不完善，無(wú)法達(dá)到理想的研究效果；而犬的頸部動(dòng)脈分支豐富，不易通過(guò)阻斷單支血管形成穩(wěn)定病灶[4]。相比之下，大鼠由于具有與人類相近的腦血管解剖結(jié)構(gòu)，能較好地模擬現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上腦梗死的病理狀態(tài)；價(jià)格較為低廉，容易獲取，有利于大樣本重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展；大鼠的生理病理學(xué)研究較為成熟，可供參考的文獻(xiàn)資料豐富；頸部血管清晰，變異性小，手術(shù)操作容易；腦缺血面積容易掌控，梗死體積較大且恒定；性情溫順，種系純合型較好；繁殖、生長(zhǎng)發(fā)育較快；血量較大，容易采集，可同時(shí)滿足一項(xiàng)研究中的多個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)需求等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)十分受研究者青睞[5-7]。

國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，由于受雌性激素對(duì)腦神經(jīng)保護(hù)作用的影響，雌性大鼠腦缺血后的梗死面積明顯小于雄性大鼠，因此，腦血管疾病的研究更多推薦選用雄性大鼠[8]。郭淑娟等[9]通過(guò)探究不同性別大鼠腦梗死體積及腦血流值的差異發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷后雌性大鼠的腦梗死體積明顯小于雄性大鼠，并推測(cè)這可能與雌性大鼠的低基礎(chǔ)腦血流值有關(guān)。閆峰等[10]亦研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠的腦血流基礎(chǔ)值明顯高于雌性大鼠，推測(cè)雌性大鼠腦梗死面積小、病死率低可能是由于其腦血流基礎(chǔ)值水平相對(duì)較低導(dǎo)致對(duì)腦缺血再灌注的耐受性提高引起的。黃會(huì)芝等[11]通過(guò)探討性別因素對(duì)新生大鼠的缺氧缺血性腦損傷腦發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生雄性大鼠更容易受到缺氧缺血性腦損傷危害的影響，出現(xiàn)嚴(yán)重的腦損傷以及偏癱癥狀。

另外，動(dòng)物的周齡大小和體重也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功率有一定的影響。當(dāng)動(dòng)物體重太小時(shí)，線栓不易插入，造模難度加大，甚至?xí)p傷血管壁，導(dǎo)致出血意外；當(dāng)體重太大時(shí)，可能會(huì)因?yàn)榫€栓無(wú)法很好栓塞血管，血流阻斷不完全，達(dá)不到理想的缺血效果。Tang等[12-14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)造模大鼠約為8周齡大小，體質(zhì)量控制在250～300 g時(shí)，既能達(dá)到理想的造模效果，又能將手術(shù)對(duì)大鼠造成的傷害降到最低。甄毅嵐等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體質(zhì)量是影響腦缺血再灌注造模穩(wěn)定性的重要因素，當(dāng)雄性小鼠體重在25 g左右時(shí)，模型的死亡率相對(duì)較低，而成功率相對(duì)較高，是造模的理想選擇。

2 腦缺血再灌注動(dòng)物模型的建立

2.1 造模方法的選擇 近年來(lái)創(chuàng)立發(fā)展的腦缺血再灌注動(dòng)物模型的造模方法主要包括開(kāi)顱電凝阻斷法、開(kāi)顱結(jié)扎法、光化學(xué)誘導(dǎo)法、線栓法、氣囊栓塞法、顱外動(dòng)脈注入微栓子等，其中線栓法最為常用[16-17]。采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型是由Koizumi等[18]在1986年首次提出的；1989年Longa等[19]對(duì)該造模方法進(jìn)行了改良，為模擬人類疾病理想模型提供了一個(gè)全新的實(shí)驗(yàn)方法。該方法具有不需要開(kāi)顱、對(duì)動(dòng)物損傷較小、操作簡(jiǎn)單、缺血部位易于掌握且恒定、能有效控制再灌注時(shí)間、閉塞效果較為理想的特點(diǎn)，因此，被國(guó)內(nèi)外研究者一直沿用至今。

為提高造模的成功率，解決插線困難、死亡率高等問(wèn)題，近年來(lái)，有一些研究者對(duì)Longa的插線法又進(jìn)行了一系列的改進(jìn)。目前，線栓的進(jìn)入方式主要有從頸外動(dòng)脈殘端插入至頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段和頸總或頸內(nèi)動(dòng)脈切口插入兩種。兩種進(jìn)線方法各有優(yōu)劣，經(jīng)頸外動(dòng)脈插入魚線的方法通過(guò)游離頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，并從頸外動(dòng)脈插入魚線直至顱內(nèi)，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要結(jié)扎頸總動(dòng)脈，能有效實(shí)現(xiàn)頸總動(dòng)脈的再灌注，而缺點(diǎn)在于由于受頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈之間形成的夾角的影響，導(dǎo)致造模手術(shù)的難度加大，甚至需要用顯微鏡輔助完成；相比之下，從頸總動(dòng)脈進(jìn)線操作難度低很多，但因該方法需要結(jié)扎頸總動(dòng)脈，導(dǎo)致再灌注時(shí)主要借助對(duì)側(cè)循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)，這與臨床病人實(shí)際病理表現(xiàn)存在一定差異[20]。孫宇等[21]提出線栓從頸總近頸內(nèi)外分叉處進(jìn)入血管制備的大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型梗死灶恒定、耗時(shí)少。徐秋英等[22]通過(guò)結(jié)扎右翼腭動(dòng)脈、右頸外動(dòng)脈后，在右頸外動(dòng)脈距結(jié)扎處近心端處開(kāi)一小口，將線栓經(jīng)小口沿頸內(nèi)動(dòng)脈推進(jìn)入顱以阻斷大腦中動(dòng)脈血流復(fù)制腦缺血再灌注模型。

研究發(fā)現(xiàn)，造模過(guò)程中如果結(jié)扎或離斷翼腭動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)的線栓周圍則更容易形成血栓，引起血管閉塞，影響再灌注時(shí)的血液供給。吳遠(yuǎn)華等[23]主張?jiān)谠炷＿^(guò)程中不進(jìn)行翼腭動(dòng)脈的分離和結(jié)扎，這樣一方面可以縮短手術(shù)時(shí)間、降低組織損傷；一方面可以減少血栓形成、降低感染風(fēng)險(xiǎn)，從而最大限度地確保造模成功率。劉波等[24]發(fā)現(xiàn)以往方法制作的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ驮谠俟嘧r(shí)容易出現(xiàn)栓線回縮，染色劑染色后顏色不明顯的現(xiàn)象，因此，其在線栓長(zhǎng)度和染色操作上進(jìn)行了改良，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加線栓長(zhǎng)度可以明顯降低線栓回縮到切口的發(fā)生率，同時(shí)再灌注耗時(shí)也顯著縮短，另外采用棕色安瓿進(jìn)行染色能提升染色的效果。

2.2 線栓選擇及進(jìn)線深度 理想的大樣本腦缺血再灌注動(dòng)物模型應(yīng)該盡可能地具備梗死部位及面積一致、穩(wěn)定性高、可重復(fù)的特點(diǎn)，否則將可能嚴(yán)重影響研究結(jié)果的可信程度[25-26]。腦缺血再灌注動(dòng)物模型的質(zhì)量及成功率受多種因素影響，其中選擇合適的線栓至關(guān)重要。目前可供選擇的線栓種類繁多，其中包括尼龍線栓、魚線、聚乙烯醇線栓等。近年來(lái)許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，采用尼龍線制作的線栓造模對(duì)動(dòng)物的影響最小，模型穩(wěn)定好，并且具有很好的可重復(fù)性。尼龍線栓使用較多的是3-0和4-0兩種規(guī)格的線，由于3-0尼龍線栓在操作時(shí)較4-0的線更容易導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下隙出血，因此4-0尼龍線更為常用。Koizumi等[18]曾提出通過(guò)在尼龍線前端包裹硅樹(shù)脂的方式制作標(biāo)準(zhǔn)的線栓；而Longa等[19]則主張通過(guò)燒灼的方法使尼龍線前端變成光滑圓頭，經(jīng)加工后制作標(biāo)準(zhǔn)的栓塞線栓。

為進(jìn)一步提升線栓的適用程度和造模成功率，有研究者對(duì)線栓的制備進(jìn)行了改良。劉波等[24，27]在Longa EZ制作方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，即將尼龍線前端燒灼成圓形之后，放入多聚賴氨酸溶液中包裹后使用。李洪亮等[28]采用固體石蠟包裹的方式制備線栓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法制作的線栓前端光滑圓鈍、大小一致，在造模時(shí)不易損傷動(dòng)脈血管，大大提高了造模的成功率和缺血再灌注效果。張文芳等[29]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于體質(zhì)量25～30 g的小鼠，采用頭部直徑為0.26 mm的線栓進(jìn)行造模，成功率高，腦梗死面積大，且具有更好的可重復(fù)性。

另外，除了選擇合適的線栓之外，進(jìn)線深度也是困擾研究者多年的疑難問(wèn)題，進(jìn)線深度太過(guò)容易刺破顱內(nèi)Willis環(huán)血管，從而造成蛛網(wǎng)膜下隙出血，產(chǎn)生不可逆影響[30]。張亞敏等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于體質(zhì)量為(238±6) g的大鼠，線栓進(jìn)線深度為18 mm便能達(dá)到大腦中動(dòng)脈入口處，此時(shí)指端會(huì)有明顯的阻力，不可強(qiáng)行用力，否則進(jìn)線過(guò)深容易引起蛛網(wǎng)膜下隙出血，或者將大腦中動(dòng)脈完全堵塞，出現(xiàn)大面積腦梗死。劉國(guó)軍等[31]通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，線栓進(jìn)線深度越大大鼠腦梗死體積也越大，而大鼠成活的概率卻越??；當(dāng)大鼠體質(zhì)量在260～300 g時(shí)，進(jìn)線深度控制在20 mm，能很好地保證造模成功率。在再灌注方面，Heydenreich等[32]建議在栓塞1.5 h后將線栓拔出，完成再灌注；劉婭迪等[33]則主張?jiān)? h后拔出線栓，恢復(fù)腦血流24 h實(shí)現(xiàn)再灌注。

3 痰瘀互結(jié)證型的建立

成功的腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型對(duì)于研究腦梗死病人的生理病理特點(diǎn)以及臨床診治具有非常重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝紊亂和血液流變學(xué)的改變分別是“痰濁”“瘀血”的主要生物學(xué)機(jī)制之一[34]。腦動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)因素，而動(dòng)脈粥樣硬化又是缺血性腦卒中發(fā)病的重要病理學(xué)基礎(chǔ)之一。動(dòng)脈血管內(nèi)脂質(zhì)沉積、血小板聚集導(dǎo)致血管壁狹窄，血行遲緩，均屬于中醫(yī)學(xué)上“痰濁”“瘀血”的表現(xiàn)。凌爽等[35]研究痰瘀互結(jié)證型模型大鼠的血流動(dòng)力學(xué)改變及紅細(xì)胞膜的生物學(xué)特征變化發(fā)現(xiàn)，通過(guò)喂養(yǎng)脂肪乳劑(由膽固醇、豬油、膽鹽等組成)可導(dǎo)致膽固醇升高，引起血漿黏度增大，紅細(xì)胞膜血清超氧化物歧化酶(SOD)酶活力降低。宋建民等[36]通過(guò)灌胃高脂食物(由豬油、膽固醇、甲基硫氧嘧啶組成)6個(gè)月后，插入微型雙極電凝鑷凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈的方法復(fù)制痰瘀型腦缺血再灌注大鼠模型，并予以痰瘀同治的腦泰通顆粒治療驗(yàn)證模型中醫(yī)證型成功。

潘永明等[37]通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)大耳白黑眼(WHBE)兔結(jié)合手術(shù)造模的方法建立痰瘀互結(jié)證心肌缺血模型，并通過(guò)檢測(cè)血脂代謝變化及血液流變學(xué)指標(biāo)變化驗(yàn)證模型中醫(yī)證型。李衛(wèi)民等[38]采用高脂飲食(由豬油、膽固醇、甲硫氧嘧啶、吐溫等組成)結(jié)合左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的方法復(fù)制缺血性腦卒中痰瘀互結(jié)證大鼠模型，并通過(guò)檢測(cè)血脂、血栓素、纖溶酶原激活物抑制物(PAI)、血液流變學(xué)等指標(biāo)的改變情況發(fā)現(xiàn)，該方法建立的模型符合腦卒中痰瘀互結(jié)證的臨床特點(diǎn)。劉抒雯等[39]采用脂肪乳(由羊油、膽固醇等組成)灌胃復(fù)合線栓法制作痰瘀互結(jié)證大腦中動(dòng)脈阻塞大鼠模型，并利用具有痰瘀同治作用的扎里奴思方進(jìn)行反證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組血液流變學(xué)(全血黏度、血漿黏度)和血脂水平[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]均明顯升高，其癥狀符合痰瘀互結(jié)證的病理表現(xiàn)；而扎里奴思方干預(yù)組大鼠的全血黏度、血漿黏度以及脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)較模型組明顯改善，此研究證實(shí)通過(guò)高脂高膽固醇飲食結(jié)合大腦中動(dòng)脈栓塞的方法可以成功復(fù)制腦缺血再灌注模型。

本課題組亦曾采用高脂喂養(yǎng)復(fù)合大腦中動(dòng)脈阻塞的方法制作腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證大鼠模型，通過(guò)4周高脂飼料喂養(yǎng)后，大鼠血脂出現(xiàn)明顯紊亂，其癥狀表現(xiàn)符合動(dòng)脈粥樣硬化和痰瘀互結(jié)證中“痰”的特點(diǎn)，再通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞的方法造成局部大腦缺血缺氧，其癥狀表現(xiàn)符合痰瘀互結(jié)證中“瘀”的特點(diǎn)[5]。

在構(gòu)建腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型方面，普遍主張采用高脂喂養(yǎng)結(jié)合一側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞的方式，該方法建立的模型會(huì)出現(xiàn)血脂代謝紊亂、血液流變學(xué)等生化指標(biāo)的改變，符合缺血性腦卒中痰瘀互結(jié)證的特點(diǎn)。

4 小 結(jié)

經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，采用線栓法制作腦缺血再灌注動(dòng)物模型的技術(shù)已趨于成熟，但關(guān)于病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究報(bào)道目前還很少。腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型同時(shí)具備了疾病西醫(yī)病理改變和中醫(yī)證候的特點(diǎn)，相比于單純的疾病模型，其更能全面、客觀、準(zhǔn)確地反映中藥或者中成藥的作用機(jī)制?；谀壳拔墨I(xiàn)研究結(jié)果了解到，大腦中動(dòng)脈阻塞是公認(rèn)的制作腦缺血再灌注動(dòng)物模型的理想方法；而在復(fù)合高脂喂養(yǎng)之后，可以成功建立病證結(jié)合腦缺血再灌注痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型。由于該模型的造模時(shí)間長(zhǎng)、手術(shù)要求高、復(fù)合影響因素多，將來(lái)仍需要更多大樣本的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)造模細(xì)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，以期為中醫(yī)藥治療腦血管疾病的研究提供更為優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物模型。