新生兒缺氧缺血性腦損傷中無菌性炎癥反應(yīng)的研究進(jìn)展

師 睿，陰懷清

新生兒缺氧缺血腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是由于產(chǎn)時窒息導(dǎo)致的嚴(yán)重腦損傷，可造成腦組織局灶性壞死和神經(jīng)細(xì)胞死亡、彌漫性白質(zhì)損傷、囊性或空腔梗死等損害，是新生兒死亡及小兒癲癇、腦癱等遠(yuǎn)期后遺癥的主要原因[1]。HIE造成的新生兒死亡約占全球新生兒死亡人數(shù)的25%[2-3]。該病每年的發(fā)病率為0.15%[4]，發(fā)展中國家的發(fā)病率更高。HIE造成的腦損傷隨著時間呈進(jìn)行性發(fā)展，這一過程與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的激活密切相關(guān)[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血導(dǎo)致的腦細(xì)胞損傷或壞死后釋放的損傷相關(guān)分子模式(damage-related molecular patterns，DAMPs)，包括高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、熱休克蛋白(heat shock protein，HSPs)、S100鈣結(jié)合蛋白等，通過激活先天性免疫系統(tǒng)的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重HIE的腦損傷，因此，這些DAMPs或許可以作為研究HIE治療策略的新靶點或生物標(biāo)志物。本研究就DAMPs引發(fā)的無菌性炎癥在HIE中的作用機(jī)制及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 無菌性炎癥反應(yīng)機(jī)制

在病原微生物引起的炎癥反應(yīng)中，天然免疫反應(yīng)提供了抵御病原體入侵的第一道防線。由巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等組成的天然免疫系統(tǒng)通過PRRs識別一些特定的病原菌及其產(chǎn)物，如肽聚糖、脂多糖、DNA、RNA等具有某些共同的非特異性、高度保守且對病原體生存和致病性必要的分子結(jié)構(gòu)，即病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引起宿主的固有免疫反應(yīng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)由受損或壞死細(xì)胞釋放的細(xì)胞內(nèi)容物中的某些分子，也能夠激活先天免疫細(xì)胞的PRRs，誘發(fā)免疫反應(yīng)，這些分子統(tǒng)稱為DAMPs，由于DAMPs引發(fā)的炎癥反應(yīng)與病原體感染無關(guān)，因此被稱為無菌性炎癥[6]。

DAMPs是指機(jī)體自身細(xì)胞所釋放的內(nèi)源性危險信號，由一些受損或壞死組織及某些激活的免疫細(xì)胞釋放[7]。正常情況下這些分子存在于細(xì)胞內(nèi)，不被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別，當(dāng)細(xì)胞遭受缺血或創(chuàng)傷等刺激，細(xì)胞壞死導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外空間，通過結(jié)合非免疫細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)及天然免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)上的PRRs，激活無菌性炎癥[6]。來自壞死細(xì)胞的典型DAMPs包括HMGB1、HSPs、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和尿酸等。DAMPs還包括一些細(xì)胞外基質(zhì)碎片，例如透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素等[6]。在細(xì)胞內(nèi)儲存的促炎細(xì)胞因子和趨化因子如白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-33等，為條件性或者誘導(dǎo)性DAMPs，可在一定條件下由壞死細(xì)胞釋放介導(dǎo)無菌性炎癥反應(yīng)[8-10]。目前已知的PRRs包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體(retinoic acid-induced gene Ⅰ-like receptors，RLRs)、C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLS)和DNA環(huán)狀傳感器[11]。還有許多非PRRs跨膜蛋白，包括晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、髓細(xì)胞觸發(fā)受體(triggering receptors expressed on myeloid cells，TREMs)、幾種G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)和離子通道也被證明可結(jié)合DAMPs。這些受體主要分布于固有免疫細(xì)胞表面，可激活啟動多種信號通路，促進(jìn)各種免疫細(xì)胞的遷移和激活，釋放促炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ)[7]。

2 DAMPs在HIE腦損傷中的作用機(jī)制

2.1 HIE腦損傷中的免疫細(xì)胞 動物實驗證明，隨著孕期進(jìn)展，發(fā)育中的大腦越來越容易受到HIE的損傷，這是因為HIE引起的能量缺失使得處于高代謝水平的大腦代謝嚴(yán)重受阻，從而引起神經(jīng)細(xì)胞大量死亡[2，12]。HIE腦損傷的結(jié)局與神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[13]。核心缺血區(qū)的能量衰竭和缺氧會觸發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞死亡、神經(jīng)元損傷、血腦屏障破壞和炎癥反應(yīng)的啟動[14]。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，如核酸(線粒體DNA)、脂質(zhì)(如氧化磷脂)和蛋白質(zhì)(如HMGB1、過氧化物酶)釋放到細(xì)胞外空間，作為DAMPs結(jié)合常駐免疫細(xì)胞上的PRRs，激活促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[15-18]。

2.1.1 中樞免疫細(xì)胞 小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，在缺氧缺血后的炎癥及免疫反應(yīng)中扮演重要角色[19]。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞是“靜止”狀態(tài)，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。缺氧缺血發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖并對損傷誘導(dǎo)的DAMPs釋放迅速做出反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞中PRRs被激活，使得小膠質(zhì)細(xì)胞變成阿米巴樣形態(tài)，清除凋亡細(xì)胞和缺血區(qū)域的碎片，同時產(chǎn)生促炎性因子IL-1和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，激活免疫反應(yīng)，破壞血腦屏障[20-21]。新生兒血腦屏障未發(fā)育完善，大量外周炎性因子通過血腦屏障浸潤腦組織，引起更嚴(yán)重的腦損傷。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞還會產(chǎn)生過多的ROS和一氧化氮(NO)，引起大腦的氧化應(yīng)激損傷[22]。同時活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞還可表現(xiàn)出M2巨噬細(xì)胞抗炎表型，釋放抗炎和神經(jīng)營養(yǎng)因子，具備免疫抑制和神經(jīng)保護(hù)特性，能夠促進(jìn)血管生成、組織重塑和神經(jīng)修復(fù)[23]。

反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是缺血性損傷后病理改變的另一個標(biāo)志[24]。缺氧缺血損傷發(fā)生后，星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大、增殖，Ca2+信號傳導(dǎo)增加，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6)和趨化因子的產(chǎn)生[25]，并且在受損的大腦半球形成膠質(zhì)瘢痕，炎癥初期可以起到保護(hù)神經(jīng)元、修復(fù)血腦屏障、限制炎癥蔓延的作用[26]。但隨著損傷加重，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量神經(jīng)毒性物質(zhì)[細(xì)胞因子、一氧化氮合酶(NOS)等]損傷神經(jīng)元，抑制神經(jīng)再生；同時分泌各種趨化因子，吸引中性粒細(xì)胞等外周免疫細(xì)胞向損傷部位遷移，進(jìn)一步加重腦損傷[27]。但是，在成人腦缺血損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞也可產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子(IL-9、IL-10和IL-11等)，并通過 TLR3的激活促進(jìn)組織修復(fù)[28]。提示星形膠質(zhì)細(xì)胞在新生兒HIE的炎癥及神經(jīng)修復(fù)過程中可能扮演重要角色。

2.1.2 外周免疫細(xì)胞 血腦屏障的破壞和中樞固有免疫細(xì)胞產(chǎn)生的高水平的促炎介質(zhì)將吸引缺血區(qū)域的外周免疫細(xì)胞。中性粒細(xì)胞在缺血部位早期被招募，通過MMPs的分泌，以及ROS和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)的產(chǎn)生，參與血腦屏障的破壞[29]。單核細(xì)胞在這一過程中初期表現(xiàn)出促炎作用，之后又表達(dá)抗炎作用[30]。另外，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞也在血腦屏障破壞后由外周向大腦浸潤，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，對大腦造成損傷[31]。

2.2 HIE腦損傷中的無菌性炎癥反應(yīng) 在HIE腦損傷過程中，一些典型的DAMPs通過激活大腦中固有免疫細(xì)胞的PRRs激活中樞免疫系統(tǒng)，引起一系列炎癥反應(yīng)，參與神經(jīng)細(xì)胞損傷與修復(fù)過程。

2.2.1 HMGB1 HMGB1是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的非組蛋白核蛋白，由215個氨基酸組成，具有高電泳遷移率[32]。正常情況下HMGB1位于細(xì)胞核內(nèi)，作為分子伴侶參與DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等，在發(fā)育的大腦中，還可作為神經(jīng)突起生長因子發(fā)揮作用[33]。然而，在損傷過程中，HMGB1被受損細(xì)胞和活化的免疫細(xì)胞釋放到細(xì)胞外空間，作為一種DAMPs發(fā)揮促炎介質(zhì)作用，參與炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。研究表明，在成人缺血性腦損傷中，HMGB1從神經(jīng)元核內(nèi)轉(zhuǎn)移到腦實質(zhì)。細(xì)胞外的HMGB1刺激谷氨酸釋放、促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血腦屏障損傷[33]。在成年嚙齒動物缺血性腦卒中模型中，HMGB1可通過識別TLRs和RAGE，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[34]。而在HIE新生兒的外周血中，HMGB1表達(dá)增加[35]。Chen等[36]在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型中發(fā)現(xiàn)HMGB1在缺氧損傷后3 h就從神經(jīng)元核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。HMGB1還可能導(dǎo)致HIE新生大鼠大腦皮層M1/M2小膠質(zhì)細(xì)胞極化失衡，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，而用藥物阻斷HMGB1信號則會減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的這種不平衡極化，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)[37]。提示HMGB1可能是圍生期窒息所致腦損傷的早期生物標(biāo)志物，或可作為治療HIE的新靶點。

2.2.2 S100蛋白 S100蛋白家族由24個成員組成，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞內(nèi)，S100蛋白通過與多種靶蛋白(包括酶、細(xì)胞骨架亞基、受體、轉(zhuǎn)錄因子和核酸)相互作用，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、Ca2+穩(wěn)態(tài)、能量代謝、炎癥等活動。細(xì)胞外的S100蛋白可作為一種DAMPs，通過激活固有免疫細(xì)胞，參與先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細(xì)胞遷移和趨化作用、組織發(fā)育和修復(fù)等過程。在神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元亞群中存在S100β，參與腦損傷等病理過程[38]。有研究表明，S100β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷如腦卒中、蛛網(wǎng)膜下隙出血、腦外傷后升高，并與病人預(yù)后相關(guān)[39]。在兒童中，足月兒窒息后24 h內(nèi)血清S100蛋白水平升高，被認(rèn)為與HIE相關(guān)。S100蛋白也是衡量新生兒HIE腦損傷程度的標(biāo)志物之一，在中、重度HIE患兒以及腦癱患兒中血清S100蛋白水平升高最顯著[40]。Bersani 等[41]通過檢測亞低溫治療后HIE新生兒尿液中的S100蛋白水平，提出S100蛋白可以作為評估亞低溫治療以及復(fù)溫時間窗的觀測指標(biāo)。但是關(guān)于S100蛋白在HIE腦損傷中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

2.2.3 HSPs HSPs主要作為細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶，催化蛋白質(zhì)的折疊、變性蛋白質(zhì)的復(fù)性和引導(dǎo)不可逆損傷蛋白質(zhì)的降解。在腦缺氧、缺血和應(yīng)激狀態(tài)下，HSPs在缺血區(qū)域或附近的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且通過防止受損蛋白質(zhì)的聚集和促進(jìn)新生蛋白質(zhì)的組裝來保護(hù)細(xì)胞[42]。HSPs還可通過抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)特性發(fā)揮潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[43]。有研究證明，HSP70在缺氧缺血的嬰兒中表達(dá)，并且建議測定嬰兒腦脊液或母親血清中的HSP70水平。HSP70升高的時間點可能對產(chǎn)前診斷和終止妊娠至關(guān)重要[44]。高表達(dá)HSPs轉(zhuǎn)基因大鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞可以抵抗興奮性毒素和缺氧、缺糖的損害[45]。HSPs還被證明可通過調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞/神經(jīng)祖細(xì)胞直接或作為促血管生成因子的來源，修復(fù)血腦屏障[46-47]。因此，推測HSPs在HIE后的腦損傷過程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并且可以用于HIE的早期診斷。

3 小 結(jié)

HIE后誘導(dǎo)的DAMPs釋放激活固有免疫細(xì)胞的PRRs引起的無菌性炎癥反應(yīng)在新生兒腦損傷的過程中起重要作用。在新生兒HIE腦損傷的過程中，一些DAMPs(如HMGB1)作為炎癥誘導(dǎo)因子激活小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的中樞免疫系統(tǒng)，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷；而在后期的損傷修復(fù)過程中，一些分子如HSPs等可以對抗一些蛋白的錯誤折疊，從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。另外，這些DAMPs的表達(dá)水平因時間進(jìn)展而有所不同，因此，其也可以作為新生兒HIE腦損傷的生物標(biāo)志物，指導(dǎo)HIE治療。目前，對于新生兒HIE的主要治療仍為亞低溫治療，但是其遠(yuǎn)期療效欠佳。因此，針對炎癥和免疫失調(diào)的輔助治療可能有助于提高低溫治療的整體療效，進(jìn)一步改善HIE患兒的病死率及遠(yuǎn)期后遺癥的發(fā)生。