大連地區(qū)先兆性流產(chǎn)與亞甲基四氫葉酸還原酶多態(tài)性關(guān)系的研究

孫紹華，劉瑩，于海華

（大連市婦女兒童醫(yī)療中心（集團(tuán)）遺傳代謝醫(yī)療中心，遼寧 大連 116000）

葉酸是人體自身不能合成的重要營養(yǎng)素，屬于B族的水溶性維生素。經(jīng)過腸道吸收的葉酸通過亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）轉(zhuǎn)化生成5-亞甲基四氫葉酸，不僅可提供同型半胱氨酸的代謝過程中所必須的甲基供體，同時(shí)在細(xì)胞周期等生命活動(dòng)中具有重要作用，參與DNA 氧化損傷修復(fù)、組織的生長、細(xì)胞的增殖、蛋白質(zhì)代謝等活動(dòng)，與維生素B12共同作用促進(jìn)紅細(xì)胞的生成、成熟[1-2]。同型半胱氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶由于基因突變導(dǎo)致MTHFR基因677C/T多態(tài)性有3個(gè)基因型，分別是CC型（野生型）、CT 型（雜合突變型）及TT 型（純和突變型），MTHFR酶活性降低會(huì)導(dǎo)致同型半胱氨酸向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)化率降低，因此，同型半胱氨酸在TT基因型的人群中水平會(huì)顯著增高，高同型半胱氨酸對(duì)胚胎發(fā)育有一定的影響，可能會(huì)導(dǎo)致唐氏綜合征、神經(jīng)管畸形、先天性心臟病等出生缺陷；同時(shí)，妊娠期高血壓、胎盤早剝、反復(fù)流產(chǎn)、先兆子?jì)沟仍衅诩膊〉陌l(fā)生可能與血漿中同型半胱氨酸水平升高有一定的相關(guān)性[3]。先兆性流產(chǎn)[4-5]是一種較常見的孕期癥狀，是指在孕28 周前陰道出現(xiàn)少量的流血，繼而出現(xiàn)陣發(fā)性下腹疼痛或腰痛，經(jīng)盆腔檢查子宮口未開胎膜完整，無妊娠物排出，癥狀嚴(yán)重者，可能發(fā)展為流產(chǎn)[6-7]，對(duì)孕婦及家屬造成較大的心理傷害。本研究旨在檢測本地區(qū)葉酸代謝相關(guān)的基因MTHFR多態(tài)性的分布情況，分析本地區(qū)育齡女性先兆先流產(chǎn)與MTHFR 多態(tài)性的相關(guān)性，以期為預(yù)防本地區(qū)孕婦先兆性流產(chǎn)及孕期葉酸補(bǔ)充提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月至2020年5月于本院就診的380例先兆流產(chǎn)患者作為先兆流產(chǎn)組，另選取同期孕期各項(xiàng)檢測指標(biāo)均正常且無任何不良妊娠疾病的孕期女性508名作為正常對(duì)照組。所有研究對(duì)象孕齡均＜13 周，年齡22～40 歲。研究對(duì)象均簽署葉酸基因檢測知情同意書，抽取外周血于EDTA 抗凝管保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法1.2.1 設(shè)備與試劑 Fluorescent Quantitative PCR Detection System 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測系統(tǒng)9600 系列。亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）購于泰樂德醫(yī)療有限公司。

1.2.2 檢測方法 取EDTA 抗凝管中50 μl 全血樣本加入1.5 ml離心管中，加入150 μl氯化銨、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸混合液沉淀DNA，14 000 r/min離心2 min，棄上清，加入150 μl 十二烷基硫酸鈉和蛋白酶K混合液進(jìn)行洗滌，14 000 r/min離心2 min，棄上清，加入50 μl 裂解液混勻65°C 水浴5 min，最后加入15 μl含有三羥甲基氨基甲烷、碳酸氫鉀的穩(wěn)定液，混勻后檢測DNA檢測濃度。八連管反應(yīng)孔中加入預(yù)配置好的PCR擴(kuò)增體系（氯化鎂、Taq酶，探針，脫氧核苷酸等）16 μl，分別加入4 μl 的待檢測樣本DNA，同時(shí)做好陰性陽性對(duì)照。探針：MTHFR1-F 5’-CGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3，MTHFR1-R 5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3。

將上述放入反應(yīng)管放入熒光定量PCR 擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增程序如下：50 ℃2 min，95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，45個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增反應(yīng)完成后，收集熒光信號(hào)進(jìn)行檢測結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn) 對(duì)兩組MTHFR基因多態(tài)性分布數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，樣本有區(qū)域代表性符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡規(guī)律，可以對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析。

2.2 兩組MTHFR 的基因型構(gòu)成與基因頻率比較正常對(duì)照組的MTHFR C667T 位點(diǎn)野生CC 型占21.6%，雜合突變CT 型占48.2%，純合突變型TT 型占30.2%；先兆流產(chǎn)組MTHFR C667T 位點(diǎn)野生CC型占17.9%，雜合突變CT 型占47.3%，純合突變型TT 型占34.8%，兩組MTHFR C677T 基因型構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

正常對(duì)照組突變基因T 的基因頻率為54.3% ，C的基因頻率為45.7%；先兆流產(chǎn)組突變基因T的基因頻率為58.4% ，C的基因頻率為41.6%。兩組C、T等位基因型頻率分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

葉酸的代謝吸收在胎兒生長發(fā)育過程中十分重要，妊娠期間孕婦對(duì)葉酸的需求量是普通人群的4 倍，人體內(nèi)葉酸、同型半胱氨酸的水平與MTHFR基因多態(tài)性相關(guān)，如葉酸代謝酶活性降低導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高可能會(huì)引發(fā)妊娠期孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎盤早剝、妊娠高血壓及胎兒神經(jīng)管畸形等出生缺陷[8]。同型半胱氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶MTHFR[9]能夠催化5，10 -亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，可為同型半胱氨酸代謝提供甲基，因此，能夠降低同型半胱氨酸水平。MTHFR基因位于1 號(hào)染色體q36.3，長度約為2.2 kb，共有11個(gè)外顯子，已發(fā)現(xiàn)MTHFR有20余種基因多態(tài)性的突變位點(diǎn)，最常見的是第5 外顯子上677 位點(diǎn)的突變，此位點(diǎn)的胸腺嘧啶替代了胞嘧啶，在體內(nèi)形成CC 型、CT 型及TT 型3 個(gè)基因型，MTHFR 酶的活性降低是由于此突變導(dǎo)致丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸所致。有研究指出在CT 基因型（雜合突變型）人群中MTHFR 酶活性降低約35% ，在TT 基因型（純合突變型）人群中MTHFR 酶活性降低50%～70%[10]，MTHFR酶活性降低，導(dǎo)致血漿中同型半胱氨酸增高，可能會(huì)引發(fā)一系列出生缺陷。

本研究對(duì)該地區(qū)先兆流產(chǎn)的女性和孕期表型正常的女性進(jìn)行MTHFR 基因多態(tài)性檢測，結(jié)果顯示，先兆流產(chǎn)組與正常對(duì)照組MTHFR基因型構(gòu)成、等位基因分布結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，本地區(qū)MTHFR C677T位點(diǎn)生突變與先兆流產(chǎn)并無明顯相關(guān)性，引起先兆流產(chǎn)的因素復(fù)雜多樣，受環(huán)境、營養(yǎng)狀況和遺傳因素的共同影響，尚需進(jìn)一步分析檢測。

目前，我國推行的孕期保健措施是指導(dǎo)孕婦在孕前3 個(gè)月至孕早期3 個(gè)月每天補(bǔ)充0.4 mg 的葉酸，在葉酸攝入無差異的情況下，由于MTHFR 突變，TT型、CT型個(gè)體相較于CC型個(gè)體，體內(nèi)葉酸水平降低20%左右，導(dǎo)致部分孕婦葉酸缺乏，進(jìn)而使子代存在神經(jīng)管畸形、唐氏綜合征及心臟畸形等風(fēng)險(xiǎn)[11-13]，通過對(duì)備孕女性或者孕早期女性進(jìn)行MTHFR C677T 基因遺傳學(xué)檢測，并根據(jù)本地區(qū)葉酸代謝基因型分布的特點(diǎn)，因人而異制定個(gè)性化的葉酸補(bǔ)充方案，對(duì)遺傳上存在葉酸代謝障礙風(fēng)險(xiǎn)的人群（如TT 型）指導(dǎo)其增加補(bǔ)充葉酸劑量，幫助孕期女性合理補(bǔ)充葉酸，能有效達(dá)到預(yù)防出生缺陷的目的。