環(huán)丙沙星和銅復(fù)合污染下河流底質(zhì)微生物群落與抗生素抗性基因的交互關(guān)系

李 軼，胡 童，王琳瓊，范晨陽(yáng)

(1.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué)淺水湖泊綜合治理與資源開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；3.河海大學(xué)海洋學(xué)院，江蘇 南京 210098)

抗生素具有高效、強(qiáng)力、廣譜的殺菌特性，在醫(yī)療、畜牧、養(yǎng)殖等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)抗生素使用量達(dá)到16.1萬(wàn)t。人和畜禽對(duì)抗生素的利用率有限，攝入的抗生素約有40%會(huì)排出體外，這些含有抗生素的污水部分被直接排入水環(huán)境中[1-2]。盡管環(huán)境中微生物可對(duì)抗生素等有機(jī)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化和降解，但由于其降解率較低[3]，導(dǎo)致其在環(huán)境中累積。大量研究表明，抗生素的過(guò)量使用是抗生素抗性基因 (antibiotic resistance genes，ARGs) 在環(huán)境中出現(xiàn)和廣泛傳播最主要和直接的原因[4]。通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件 (mobile genetic elements，MGEs) ，ARGs從基因組轉(zhuǎn)移到噬菌體或質(zhì)粒，從而促進(jìn)了水環(huán)境中耐藥細(xì)菌 (antibiotic resistance bacteria，ARB) 和ARGs的增殖和傳播[5]。

河流底質(zhì)為微生物提供了優(yōu)良的棲息場(chǎng)所，是水環(huán)境中微生物生命活動(dòng)最活躍的區(qū)域，同時(shí)微生物也是河流中物質(zhì)循環(huán)的主要參與者，決定著河流生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[6]。ARGs作為一種基因?qū)用娴奈廴疚?，其傳播和擴(kuò)散與微生物的生命活動(dòng)存在聯(lián)系。微生物群落與ARGs之間有著復(fù)雜的相互作用機(jī)制，微生物群落組成的變化會(huì)影響ARGs宿主或敏感菌的豐度變化[7-8]。反之，ARGs的大量排入會(huì)對(duì)環(huán)境中土著微生物群落造成影響，獲得ARGs的菌種可能被賦予更強(qiáng)的生存優(yōu)勢(shì)，再加上外源污染的干擾，最終導(dǎo)致微生物群落組成的變化[9-10]。此外，在一定條件下，ARGs會(huì)在不同種屬的細(xì)菌間傳播，一旦人類致病菌獲得ARGs，就可能會(huì)對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致抗生素治療的失效，威脅人類健康[11]。

河流底質(zhì)作為眾多污染物的“匯”，抗生素、重金屬等污染物被頻繁檢出。胡冠九等[12]對(duì)江蘇省某市河流中抗生素濃度進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明磺胺類含量相對(duì)最高 (51.9%)，其次是四環(huán)素類 (29.9%) 和喹諾酮類 (14.5%)，其中磺胺類藥物最高質(zhì)量濃度可達(dá) 52.7 ng/L。封夢(mèng)娟等[13]對(duì)長(zhǎng)江南京段水源水中14種抗生素進(jìn)行測(cè)定，平均質(zhì)量濃度為 0.14～49.91 ng/L，其中克林霉素作為首要污染抗生素，其質(zhì)量濃度高達(dá) 739.44 ng/L。王龍飛等[14]研究表明，在河流底泥和附著生物膜中磺胺類抗生素質(zhì)量濃度分別為NF (未檢出)～47.3 ng/g和NF～3 759.1 ng/g。另外，重金屬作為難降解污染物之一，在河流底質(zhì)中濃度較高。肖艷春等[15]對(duì)河流底泥中重金屬含量檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在污水處理廠排污口的點(diǎn)位，Ni (223.81 mg/kg) 和Cd (20.17 mg/kg) 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，而Zn和Cu呈現(xiàn)空間差異性，從河流上游至下游其質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，最高值分別可達(dá)284.55 mg/kg和95.47 mg/kg。河流底質(zhì)環(huán)境中污染物的賦存直接影響底質(zhì)微生物群落的多樣性、結(jié)構(gòu)及功能，進(jìn)而影響ARGs的分布及傳播。

抗生素在河流環(huán)境中作為主要的相關(guān)性因素可直接促進(jìn)相關(guān)ARGs的增殖與傳播，同時(shí)還可能與其他類抗性基因存在聯(lián)系[16]。盡管大多數(shù)環(huán)境中抗生素的殘留處在一個(gè)較低的水平，但仍會(huì)對(duì)ARGs有選擇作用[17]。Yang等[18]對(duì)洞庭湖中的抗生素和ARGs含量進(jìn)行了調(diào)查，8種抗生素的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)(磺胺類4種和四環(huán)素類4種)在60.02～321.04 μg/kg之間，同時(shí)在底質(zhì)樣品中sul1、sul2、tetA、tetC和tetM等抗性基因均被檢出，且ARGs、殘留抗生素和底質(zhì)特征之間存在顯著的相關(guān)性。此外，河流底質(zhì)中重金屬的賦存同樣會(huì)對(duì)ARGs施加選擇壓力，從而提高環(huán)境中ARGs的豐度[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的重金屬濃度與ARGs豐度呈正相關(guān)關(guān)系，表明ARGs豐度的增加也可能與重金屬污染有關(guān)[21-22]。然而，目前關(guān)于抗生素和重金屬?gòu)?fù)合污染條件下河流底質(zhì)微生物群落特征及其與ARGs間的交互研究較少，兩者間的相互作用關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

本文選擇環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CFC)和銅(copper，Cu)為代表性抗生素和重金屬，采集江蘇省南京市秦淮河江寧段污水處理廠上游點(diǎn)位的底質(zhì)和水體樣品進(jìn)行微宇宙試驗(yàn)。通過(guò)設(shè)計(jì)室內(nèi)馴化試驗(yàn)，利用高通量測(cè)序和熒光定量PCR等生物信息學(xué)技術(shù)，檢測(cè)分析微生物群落組成和ARGs豐度，通過(guò)部分冗余性分析、路徑分析、網(wǎng)絡(luò)分析等方法，分析微生物群落和ARGs對(duì)復(fù)合污染的響應(yīng)，考察微生物群落特征對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)及其與ARGs的交互關(guān)系，探究微生物群落及污染物對(duì)ARGs傳播擴(kuò)散的作用機(jī)制，從而為河流中ARGs的污染防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

河流底泥樣品于2021年9月8日取自于江蘇省南京市秦淮河江寧段污水處理廠上游河流，采用抓斗式采泥器采集水泥界面向下0～20 cm處的底泥。將采集到的沉積物裝入聚乙烯塑料袋中，避光封口后帶回實(shí)驗(yàn)室，去除石塊、水生動(dòng)物和植物殘?bào)w后混合均勻，隨后轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱內(nèi)保存直至馴化試驗(yàn)待用。

1.2 試劑與器材

試劑：環(huán)丙沙星(生物級(jí))、CuSO4·5H2O、Na2HPO4·2H2O、MgSO4·7H2O、NaHCO3、Na2CO3、NaNO3、Na2SO4、(NH4)2·SO4、KH2PO4、NaCl、KCl和NH4Cl均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FastDNA Spin Kit for Soil(MP bio土壤基因組DNA提取試劑盒)、SYBR Green qPCR Mix(2×實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液)、Platinum Taq DNA聚合酶、50×TAE緩沖液、6×DNA Loading Buffer、DL2000 DNA Marker和10×Ex Taq Buffer購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

器材：無(wú)菌超凈臺(tái)、高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)、移液槍(1 μL、2 μL、10 μL、100 μL和1 000 μL)、電泳儀(BIO-RAD，美國(guó))、凝膠成像儀(Tanon-3500，上海天能)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500，美國(guó)Applied Biosystems)、漩渦振蕩儀、水浴鍋(HH-4，常州普天儀器制造有限公司)和高壓滅菌鍋等。耗材有2 mL離心管、不同規(guī)格的槍頭、96孔PCR板、八連排PCR管等。所有耗材均經(jīng)過(guò)高壓滅菌鍋滅菌處理后使用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽的配置：稱取K2HPO4(3.80 g)、KH2PO4(1.00 g)、NaCl (1.00 g)、MgSO4(0.20 g)和NH4Cl (0.10 g)溶于1 L蒸餾水中，并用玻璃棒攪拌透明后，4 ℃保存待用。

馴化試驗(yàn)設(shè)置：準(zhǔn)備15個(gè)500 mL的錐形瓶作為底質(zhì)馴化培養(yǎng)的容器，共5個(gè)試驗(yàn)組，每組包括3個(gè)平行試驗(yàn)，且分別在第0 d、5 d、15 d、30 d采取底質(zhì)樣品。在每個(gè)錐形瓶中加入175 g已處理好的底質(zhì)樣品。以蒸餾水為溶劑分別配置10 mg/kg的CFC儲(chǔ)備液和1 000 mg/kg的硫酸銅儲(chǔ)備液，根據(jù)表1的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定值，量取3.5 mL CFC儲(chǔ)備液至CFC1和CC1組的6個(gè)錐形瓶中，量取8 mL CFC儲(chǔ)備液至CFC2和CC2組的6個(gè)錐形瓶中，量取16 mL硫酸銅儲(chǔ)備液至Cu、CC1和CC2組的9個(gè)錐形瓶中，最后用無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽將所有錐形瓶的凈重補(bǔ)至200 g，攪拌均勻并貼上標(biāo)簽，用封口膜封住瓶口，在25℃黑暗環(huán)境中馴化培養(yǎng)。培養(yǎng)底質(zhì)選擇秦淮河上游點(diǎn)位作為馴化基質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定參考秦淮河江寧區(qū)段CFC、Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最高值和最小抑菌濃度值(MIC)，見(jiàn)表1。

表1 室內(nèi)馴化試驗(yàn)CFC和Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定

1.3.2 微生物測(cè)序及目標(biāo)基因定量

底質(zhì)樣品DNA用FAST DNA?SPIN Kit for Soil試劑盒按操作說(shuō)明提取。對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取和質(zhì)量檢測(cè)后，預(yù)留熒光定量PCR所需的DNA樣品(約10 μL)，將剩余的DNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司(Biozeren，上海)進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序。待測(cè)序原始數(shù)據(jù)返回后，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)序列進(jìn)行優(yōu)化處理。為了保證序列及分析結(jié)果的質(zhì)量，通過(guò)QIIME(version1.17) 提取原始數(shù)據(jù)中的有效序列，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行除雜和過(guò)濾處理。按相似性大于97%的標(biāo)準(zhǔn)，將得到的優(yōu)化序列進(jìn)行OTU劃分[23]。在區(qū)分樣本后，進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類信息學(xué)分析。根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，計(jì)算Chao 1、Shannon、Simpson等微生物多樣性指數(shù)；基于物種分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)微生物群落組成和物種豐度。

室內(nèi)馴化試驗(yàn)選取9種目標(biāo)基因，分別為：16S rRNA、整合子intI1、轉(zhuǎn)座子IS26、四環(huán)素類抗性基因tetA和tetT、氟喹諾酮類抗性基因QnrA和QnrC、磺胺類抗性基因sul1、大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB，目標(biāo)基因?qū)?yīng)的正向引物、負(fù)向引物、定性和定量的退火溫度如表2所示。目標(biāo)基因PCR預(yù)試驗(yàn)選用30 μL混合的擴(kuò)增體系，包括：15 μL qPCR Mix，2 μL Mg2+(25 mmol)，兩端引物各0.5 μL，滅菌超純水10 μL和DNA模板2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min加30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s；DNA退火溫度30 s；72℃ 30 s)。反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物立即進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

表2 定量PCR方法進(jìn)行分子檢測(cè)的引物信息

目標(biāo)基因的定量檢測(cè)使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Bio-Rad CFX96 Cycler Q5 thermocycler，USA)，擴(kuò)增采用20 μL體系，具體包括：10 μL 2 × SYBR green Premix Ⅱ (TaKaRa)，兩端引物各0.4 μL，滅菌超純水8.7 μL和DNA模板0.5 μL。試驗(yàn)中的陰性對(duì)照組為反應(yīng)體系中加入2 μL的ddH2O。熒光定量PCR采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，首先將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍、102倍、103倍、104倍和105倍，將稀釋后的基因標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)為基因標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR儀檢測(cè)得到的Ct值。在檢測(cè)環(huán)境樣品時(shí)，在同一個(gè)點(diǎn)位取3次DNA樣品作為模板與標(biāo)準(zhǔn)樣品梯度溶液一起檢測(cè)。在相同試驗(yàn)檢測(cè)條件下，得到環(huán)境樣品目標(biāo)基因的Ct值，代入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算得到樣品中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)r2如表3所示。

表3 目標(biāo)基因PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Office excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪制圖表，運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)樣品進(jìn)行Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析。當(dāng)p<0.05時(shí)，認(rèn)為結(jié)果具有顯著性。組間菌種差異(LEfSe)分析在線上分析網(wǎng)站https：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/進(jìn)行。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析首先通過(guò)R語(yǔ)言psych包生成目標(biāo)相關(guān)性矩陣，再通過(guò)Gephi0.9.2軟件生成點(diǎn)、邊文件，進(jìn)而對(duì)點(diǎn)、邊文件進(jìn)行注釋，最后在該軟件導(dǎo)入點(diǎn)、邊文件，調(diào)整相關(guān)參數(shù)，完成可視化。部分冗余性分析通過(guò)R語(yǔ)言計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARGs和微生物群落對(duì)復(fù)合污染的響應(yīng)

2.1.1 CFC和Cu復(fù)合污染對(duì)ARGs豐度的影響

5個(gè)試驗(yàn)組目標(biāo)ARGs在各取樣時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)豐度如圖1所示。在所有樣品中，總ARGs相對(duì)豐度為8.19×10-3～ 1.22×10-1copies/16S rRNA copy，最高相對(duì)豐度出現(xiàn)在CFC2試驗(yàn)組。從各試驗(yàn)組來(lái)看，CFC單一污染試驗(yàn)組(CFC1組和CFC2組)的總ARGs相對(duì)豐度隨時(shí)間變化呈先上升(前15 d)后下降的趨勢(shì)。在復(fù)合污染試驗(yàn)組(CC1組和CC2組)中，總ARGs相對(duì)豐度在第5天左右達(dá)到峰值，隨后下降(p<0.05)。特別地，CFC單一污染試驗(yàn)組(CFC1組和CFC2組)和Cu單一污染試驗(yàn)組(Cu組)在總ARGs峰值上有顯著的差異性(p<0.05)。ARGs豐度在CFC1組和CFC2組中的峰值最高，是Cu組的3倍。這可能是因?yàn)镃u的生物毒性造成底質(zhì)微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或致使特定種群消失，導(dǎo)致抗性基因的潛在宿主減少，從而對(duì)參與ARGs傳播的細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用[24-25]。

圖1 各試驗(yàn)組ARGs相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化Fig.1 Changes of relative ARGs abundance in each experimental group with time

對(duì)比兩個(gè)復(fù)合污染組(CC1組和CC2組)，在濃度CFC為MIC值的CC2組中ARGs豐度更高，且每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的ARGs豐度均高于CC1組。由此推斷，CFC的MIC對(duì)ARGs增殖和傳播具有一定的促進(jìn)作用，且促進(jìn)程度更大，表明環(huán)境中的MIC值對(duì)抗生素誘導(dǎo)ARGs具有重要的作用[26]。以上結(jié)果可解釋為抗生素在一定條件下可被微生物轉(zhuǎn)化或降解，當(dāng)抗生素作為外界環(huán)境選擇壓力使得少數(shù)耐藥菌獲得更多生存資源而快速繁殖，從而加速了ARGs的增殖[3-17]。有研究表明，抗性基因豐度與抗生素及砷、銅等重金屬污染濃度呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明抗生素與重金屬?gòu)?fù)合污染促進(jìn)了環(huán)境中抗性基因的分布水平[27-28]。綜上，通過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)，表明5個(gè)試驗(yàn)組總ARGs相對(duì)豐度的時(shí)間分布呈顯著差異，也說(shuō)明不同的污染組在一定的時(shí)間段內(nèi)影響ARGs的增殖和傳播。

2.1.2 CFC和Cu復(fù)合污染對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的影響

基于物種分類學(xué)分析，在門(mén)水平上對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行歸類，獲得15個(gè)底質(zhì)樣品的微生物群落組成及相對(duì)豐度，結(jié)果如圖2所示。共有15個(gè)豐度占比超過(guò)0.5%的菌門(mén)，其中超過(guò)5%的菌門(mén)有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)，均為本試驗(yàn)樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。變形菌門(mén)是所有樣品中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的菌門(mén)，結(jié)合各試驗(yàn)組微生物群落的組成變化來(lái)看，變形菌門(mén)的豐度占比在添加Cu的試驗(yàn)組中隨時(shí)間降低，在未添加Cu的試驗(yàn)組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似的規(guī)律，說(shuō)明較高的Cu濃度對(duì)變形菌門(mén)的豐度具有抑制作用。相反，厚壁菌門(mén)則在添加Cu的試驗(yàn)組中豐度占比隨時(shí)間顯著上升，這可能與厚壁菌門(mén)細(xì)菌的耐污能力有關(guān)，也使其成為抗生素和重金屬?gòu)?fù)合污染環(huán)境下ARGs的潛在宿主[29]。酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)在各試驗(yàn)組中沒(méi)有顯著的時(shí)間變化規(guī)律。Tuo等[30]研究表明，環(huán)丙沙星對(duì)土壤優(yōu)勢(shì)微生物的影響較小，不同濃度環(huán)丙沙星污染組中門(mén)水平微生物豐度有顯著差異，各處理優(yōu)勢(shì)門(mén)水平微生物及其豐度是放線菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)，該結(jié)果與本研究結(jié)果類似。

圖2 各試驗(yàn)組樣品在門(mén)水平上的微生物群落組成Fig.2 Microbial community composition of each sediment sample at the phylum level

通過(guò)對(duì)各樣品的OTU組成進(jìn)行PCoA分析(圖3)，進(jìn)一步辨別各試驗(yàn)組樣品微生物群落組成之間的差異性。圖3表明各樣品的整體分布與污染類型顯著相關(guān)，CFC和Cu復(fù)合污染的兩個(gè)試驗(yàn)組CC1和CC2的6個(gè)點(diǎn)聚集在圖上方，CFC單一污染試驗(yàn)組的點(diǎn)都在圖右側(cè)，Cu單一污染組除1個(gè)點(diǎn)外均聚集在右下角，表明不同的污染類型是造成微生物群落組成差異性的重要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合污染和單一污染對(duì)微生物群落組成的影響不同，多數(shù)抗生素和重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響，呈現(xiàn)微生物群落組成的差異性[31]。侯俊等[32]探究了人工濕地系統(tǒng)中有機(jī)污染物對(duì)微生物群落的影響，結(jié)果表明污染物可直接改變微生物群落的豐度和多樣性，相反微生物通過(guò)降解有機(jī)污染物，從而提高了微生物群落的耐受性。孫依欣[25]認(rèn)為，鎘與環(huán)丙沙星的單一污染和復(fù)合污染試驗(yàn)組中微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的差異，單一環(huán)丙沙星處理組使得微生物群落多樣性增加，而復(fù)合污染處理組中微生物群落多樣性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖3 各試驗(yàn)組微生物群落PCoA分析Fig.3 PCoA analysis of microbial community in each experimental sample sediment

另外，將5個(gè)試驗(yàn)組的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，得到各樣品組的一級(jí)功能預(yù)測(cè)結(jié)果，如表4所示(不包括未分類序列)。由表4可見(jiàn)，新陳代謝、遺傳信息加工和環(huán)境信息處理是5個(gè)試驗(yàn)組中微生物群落的主要功能，相對(duì)豐度占比分別為48.52%～49.46%、16.56%～17.21%和12.02%～13.24%。各試驗(yàn)組一級(jí)功能預(yù)測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。如圖4所示，二級(jí)功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，氨基酸代謝和其他次生代謝產(chǎn)物的合成在CFC單一污染組中的豐度明顯高于復(fù)合污染組；復(fù)合污染組和Cu單一污染組功能的豐度組成相似，無(wú)顯著差異，表明當(dāng)CFC濃度不超過(guò)MIC值時(shí)，污染物CFC對(duì)底質(zhì)微生物群落的氨基酸代謝和其他次生代謝的代謝產(chǎn)物合成均具有促進(jìn)作用。

表4 各試驗(yàn)組樣品一級(jí)功能預(yù)測(cè)基因的分布 單位：%

圖4 每個(gè)樣品中二級(jí)功能預(yù)測(cè)基因的顯著性差異分析Fig.4 Significance difference analysis of secondary function predicted genes in each sample

2.2 CFC和Cu復(fù)合污染下微生物群落與ARGs的交互關(guān)系

基于ARGs、MGEs和微生物群落的結(jié)構(gòu)組成，采用網(wǎng)絡(luò)分析建立了ARGs、MGEs和門(mén)水平微生物群落的非隨機(jī)共發(fā)生模式，結(jié)果如圖5所示，共有23個(gè)節(jié)點(diǎn)，65條邊。整合子intI1是ARGs水平轉(zhuǎn)移的重要遺傳元件，網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，intI1是“度”最大的點(diǎn)，與tetA、tetT和sul1 3種ARGs相連，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，表明intI1在四環(huán)素類抗性基因和磺胺類抗性基因的水平轉(zhuǎn)移中可能起到重要作用。該結(jié)果與已有研究結(jié)果類似：Chen等[33]在對(duì)長(zhǎng)江口抗生素抗性基因分布特征的研究中發(fā)現(xiàn)，intI1與磺胺類抗性基因存在較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系；王永強(qiáng)[34]研究表明，艾比湖表層水和沉積物中intI1與sul1具有顯著的正相關(guān)性(p<0.01)，說(shuō)明intI1可能攜帶sul1基因在環(huán)境介質(zhì)中進(jìn)行水平遷移，從而增加了環(huán)境微生物的耐藥性。除此之外，intI1與降氨酸菌門(mén)(Aminicenantes)、綠菌門(mén)(Chlorobi)、匿桿菌門(mén)(Latescibacteria)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、硝棘菌門(mén)(Nitrospinae)、硝化螺桿菌門(mén)(Nitrospirae)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和Ignavibacteriae 8個(gè)菌群相連，除擬桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)外，均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。同時(shí)，intI1和tetT與硝化螺桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等均存在正相關(guān)性，這可能是intI1和tetT具有相同的宿主菌，intI1攜帶tetT可能在宿主菌中具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性。Lu等[35]同樣發(fā)現(xiàn)tetX和sul1與短波單胞菌屬(Brevundimonas)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)呈正相關(guān)性，表明這些細(xì)菌可能是四環(huán)素耐藥基因和磺胺耐藥基因的潛在宿主。同樣作為MGEs的插入序列，IS26與QnrA、QnrC、tetA和tetT等多種ARGs相連，沒(méi)有和微生物相關(guān)的節(jié)點(diǎn)相連，說(shuō)明IS26可能更多地在質(zhì)粒上承擔(dān)連接ARGs的工作。

圖5 ARGs及其潛在宿主菌分析Fig.5 Analysis of ARGs and their potential host bacteria

從圖5還可以看出，氟喹諾酮類抗性基因QnrC與變形菌門(mén)、硝化螺桿菌門(mén)和Ignavibacteriae相連且均呈正相關(guān)關(guān)系；四環(huán)素類抗性基因tetA與厚壁菌門(mén)呈正相關(guān)關(guān)系，和Ignavibacteriae呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；QnrA與變形菌門(mén)和硝化螺桿菌門(mén)相連，均呈正相關(guān)關(guān)系；大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB與放線菌門(mén)存在正相關(guān)關(guān)系。該結(jié)論與Dang等[36]研究結(jié)果類似，變形菌門(mén)和放線菌門(mén)是水環(huán)境中門(mén)水平的主要ARGs潛在宿主。Tuo等[30]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析表明，潛在宿主細(xì)菌大部分屬于放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，且intI2在抗性基因傳播過(guò)程中扮演重要的角色。唐偉欣等[37]對(duì)規(guī)?；笄輬?chǎng)糞便中多重耐藥菌進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，多重耐藥菌的菌門(mén)集中分布在變形菌門(mén)、后壁菌門(mén)和放線菌門(mén)。Dumas等[38]研究發(fā)現(xiàn)，硝化螺旋菌門(mén)(Pseudomonas)可能攜帶多種ARGs，具有多重耐藥性，表明這些基因間存在共抗性，或者它們與其潛在宿主之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，從而增強(qiáng)了環(huán)境微生物的耐藥性。

基于Lefse分析(圖6)，結(jié)果表明在3種污染類型中，CFC單一污染和Cu單一污染試驗(yàn)組在優(yōu)勢(shì)菌種上有明顯的差異。CFC單一污染試驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌種多為變形菌門(mén)、硝化螺桿菌門(mén)和綠菌門(mén)的細(xì)菌，而Cu單一污染試驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌種主要為厚壁菌門(mén)的細(xì)菌。這幾個(gè)菌門(mén)的細(xì)菌又恰好是網(wǎng)絡(luò)分析得出的ARGs潛在宿主，表明各試驗(yàn)組微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌種與ARGs有著緊密的聯(lián)系，潛在宿主的差異可能是造成各試驗(yàn)組中ARGs豐度差異的主要原因。何良英[39]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌綱(Bacilli)是厚壁菌門(mén)下一類重要的細(xì)菌菌群，且致病菌Listeriaceae、Streptococcaceae和Staphylococcaceae均屬于芽孢桿菌綱。值得注意的是，所屬變形菌門(mén)和厚壁門(mén)的細(xì)菌在臨床細(xì)菌抗性的全球性衛(wèi)生問(wèn)題中極其重要，發(fā)現(xiàn)了大量抗性基因及其相關(guān)MGEs[40]。多種潛在病原微生物通過(guò)MGEs進(jìn)一步傳播，將更多的抗性基因帶入環(huán)境中，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來(lái)潛在威脅。

圖6 不同污染類型試驗(yàn)組的LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of experimental groups of different pollution type

2.3 影響ARGs豐度變化的主導(dǎo)因子解析

為了較為全面地分析微生物群落、MGEs以及污染物對(duì)ARGs增殖和傳播的影響，采用偏冗余性分析對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算(圖7)。結(jié)果顯示94.4%的ARGs豐度變化被所選因素所解釋。MGEs對(duì)總ARG豐度變化的解釋率為32.54%，略高于微生物群落(27.74%)，遠(yuǎn)高于污染物(7.96%)。微生物群落與MGEs和環(huán)境因子的聯(lián)合作用對(duì)ARGs豐度變化的總解釋率為49.77%，MGEs與其他因子的聯(lián)合作用對(duì)ARGs豐度變化的總解釋率為47.65%，本研究室內(nèi)馴化試驗(yàn)結(jié)果與Zhao等[41]的研究結(jié)果類似，區(qū)別在于本研究微生物群落的總解釋率略高于MGEs。造成這一差異的可能原因?yàn)椋罕狙芯繛槭覂?nèi)試驗(yàn)，在添加較高濃度污染物的外界壓力條件下，微生物群落組成隨時(shí)間的變化更為顯著，進(jìn)而導(dǎo)致ARGs潛在宿主微生物的豐度顯著變化，最終影響ARGs的相對(duì)豐度。

圖7 MGEs、微生物群落和污染物對(duì)ARGs豐度Fig.7 Interpretation rates for effects of MGEs, bacterial community and pollutants on ARGs abundance

采取路徑分析對(duì)室內(nèi)試驗(yàn)涉及的CFC、Cu、微生物群落、MGEs和ARGs按照既定路徑進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示。從整體來(lái)看，CFC和Cu都通過(guò)多個(gè)路徑影響了ARGs的豐度變化。CFC對(duì)微生物群落具有顯著的正向影響(p<0.01)，對(duì)ARGs具有正向影響；而CFC對(duì)MGEs具有顯著的負(fù)面影響(p<0.01)；Cu對(duì)微生物群落具有負(fù)面影響，對(duì)MGEs、ARGs具有顯著的正向影響(p<0.05)；微生物群落對(duì)MGEs具有顯著的正向影響(p<0.05)，對(duì)ARGs具有正向影響；MGEs對(duì)ARGs具有顯著的正向影響(p<0.05)。

路徑分析結(jié)果表明，受到污染物(CFC和Cu)等環(huán)境壓力作用的微生物群落影響了MGEs和ARGs，而受到污染物和微生物群落雙重影響的MGEs也同樣對(duì)ARGs的傳播有重要的影響。在不同的污染條件下，每一條路徑都可能做出相應(yīng)的響應(yīng)，如，當(dāng)CFC成為環(huán)境中的主導(dǎo)污染物時(shí)，微生物群落可能受到較大的促進(jìn)作用，一方面可能促進(jìn)ARGs的垂向擴(kuò)散過(guò)程，另一方面會(huì)顯著促進(jìn)MGEs介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移過(guò)程，最終導(dǎo)致ARGs豐度的上升。類似地，Zhou等[42]利用結(jié)構(gòu)方程模型得出水質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)和人類活動(dòng)的共同作用改變了ARGs分布的結(jié)論，其中，河流水體理化參數(shù)變化引起微生物群落變化是城市水系A(chǔ)RGs的主要因素。研究結(jié)果說(shuō)明污染物或理化因子更多地通過(guò)微生物群落間接地影響ARGs的傳播和擴(kuò)散。

圖8 室內(nèi)試驗(yàn)ARGs與各影響因素的路徑分析Fig.8 Path analysis of ARGs and each influencing factor in indoor experiments

3 結(jié) 論

a.CFC單一污染、Cu單一污染和復(fù)合污染試驗(yàn)組中ARGs豐度、微生物群落組成和部分功能存在顯著差異。所有試驗(yàn)組的總ARGs相對(duì)豐度呈現(xiàn)出隨時(shí)間先增后減的變化趨勢(shì)；變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)是樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；與復(fù)合污染組相比，氨基酸代謝和其他次生代謝代謝產(chǎn)物的合成使這兩個(gè)二級(jí)功能在CFC單一污染組中有更高的豐度。

b.微生物群落一方面受CFC和Cu等環(huán)境因子的影響，另一方面對(duì)MGEs和ARGs都具有正向促進(jìn)作用。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析表明，intI1與3類ARGs和8個(gè)菌群相關(guān)，是ARGs和微生物群落之間的橋梁，也是在環(huán)境中ARGs傳播的重要途徑。

c.通過(guò)偏冗余分析發(fā)現(xiàn)，在MGEs、微生物群落和污染物中，微生物群落是對(duì)ARGs豐度變化總解釋率最高的因素(49.77%)；基于路徑分析表明，CFC和Cu等環(huán)境因子主要通過(guò)微生物群落間接地影響環(huán)境中ARGs的增殖與傳播。