基于生物信息學(xué)方法篩選精原細(xì)胞瘤進(jìn)展中的脂代謝關(guān)鍵基因

閆墨，劉帥兵，王楷斌，陳銘哲，楊闊

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

睪丸生殖細(xì)胞瘤雖然只占男性腫瘤總數(shù)的1%～2%，但是卻在15～35歲男性中有著較高的發(fā)病率，是該年齡段男性最常見的惡性實(shí)體腫瘤[1]。睪丸生殖細(xì)胞瘤可分為精原細(xì)胞瘤和非精原細(xì)胞瘤。精原細(xì)胞瘤和非精原細(xì)胞瘤分別占總病例數(shù)的60%和40%。Ⅰ期精原細(xì)胞瘤患者的5年特異性生存率可高達(dá)99.6%，且放化療對(duì)其有極佳的治療效果，但是Ⅱ期、Ⅲ期患者的總生存率則低至50%，同時(shí)伴隨著相對(duì)較大比例的復(fù)發(fā)[2-3]。

腫瘤細(xì)胞為了自身增殖和適應(yīng)環(huán)境的需要，細(xì)胞內(nèi)部的生物合成和代謝途徑均會(huì)發(fā)生適應(yīng)性的變化[4]。脂代謝作為諸多代謝途徑的一種，在腫瘤細(xì)胞膜生物合成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂化反應(yīng)以及細(xì)胞代謝供能等方面發(fā)揮重要作用，通常在轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒员硇偷哪[瘤中，會(huì)發(fā)生較大的變化[5]。脂肪酸結(jié)合蛋白1（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP1）分子量為14 kD，是一種可溶性蛋白，由127個(gè)氨基酸構(gòu)成，主要在脂肪酸的攝取、運(yùn)輸、代謝和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮功能，同時(shí)在調(diào)節(jié)脂代謝以及細(xì)胞信號(hào)通路中也起到非常重要的作用。Wu等[6]發(fā)現(xiàn)FABP1在腎透明細(xì)胞癌中與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR α）和脂蛋白脂肪酶（LPL）共表達(dá)，且可以作為重要的腎透明細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)志物；Liu等[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP1表達(dá)隨胃癌的進(jìn)展逐漸降低，同時(shí)伴隨著不良的預(yù)后，而這種不良的預(yù)后可能與其調(diào)節(jié)胃癌發(fā)展過程中的免疫微環(huán)境的作用相關(guān)。

筆者通過分析精原細(xì)胞瘤相關(guān)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FABP1在Ⅱ期、Ⅲ期精原細(xì)胞瘤中有明顯的表達(dá)升高，這能顯著影響患者的無(wú)進(jìn)展生存。另外，F(xiàn)ABP1與脂代謝相關(guān)基因顯著相關(guān)，不同表達(dá)的樣本中的免疫浸潤(rùn)也有明顯差異，這將有助于理解精原細(xì)胞瘤進(jìn)展過程中FABP1的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料下載與組織標(biāo)本獲取 從TCGA（The C ancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/）和GTEx（Genotype-Tissue Expression Program，https://commonfund.nih.gov/gtex）下載精原細(xì)胞瘤（n=156）及睪丸正常組織（n=165）RNA-seq、臨床生存及甲基化數(shù)據(jù)，以上為剔除缺失RNA與臨床數(shù)據(jù)后最終納入分析的數(shù)量。從GSEA（Gene Set Enrichment Analysis，http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）獲取的代謝相關(guān)基因集分別為甘油酯代謝（GLYCEROLIPID_METABOLIC_PROCESS）、脂蛋白生物合成（LIPOPROTEIN_BIOSYNTHETIC_PROCESS）、脂蛋白代謝（LIPOPROTEIN_METABOLIC_PROCESS）、膜脂質(zhì)代謝（MEMBRANE_LIPID_METABOLIC_PRO CESS）、磷脂生物合成（PHOSPHOLIPID_BIOSYN THETIC_PROCESS）以及磷脂代謝（PHOSPHOLIPID_METABOLIC_PROCESS），ISBN：0198506732。收 集病理科石蠟包埋的不同級(jí)別精原細(xì)胞瘤組織，每組3例。醫(yī)院倫理委員會(huì)（NO.KY2014K112）批準(zhǔn)這項(xiàng)研究并且所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 脂代謝相關(guān)差異基因篩選DESeq2包（v1.26.0）用來對(duì)Ⅰ期（n=80）以及Ⅱ、Ⅲ期（n=58）精原細(xì)胞瘤樣本RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2（FC）|≥1且P.adj<0.05，同時(shí)對(duì)差異分析得到的基因用Ensembl101（http://ftp.ensembl.org/pub/release-101/gtf/homo_sapiens/）進(jìn)行分子類型的注釋。將獲取的差異表達(dá)基因（DEGs）與GSEA中6組代謝相關(guān)基因集中的基因取交集，得到在精原細(xì)胞瘤進(jìn)展過程中與脂代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因（MRGs）。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 按照通用型二步法免疫組化試劑盒（PV-9000）說明書中操作對(duì)FABP1（1∶500，Anti-Rabbit，Proteintech Group）進(jìn)行染色。由3名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師分別在相同條件下各自閱片，每張片子隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野觀察，目標(biāo)細(xì)胞胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕黃色為陽(yáng)性染色。根據(jù)染色強(qiáng)度對(duì)切片進(jìn)行評(píng)價(jià)：陰性或未染色（無(wú)著色）；弱陽(yáng)性（淺黃色）；中等陽(yáng)性（黃色或者黃褐色）；強(qiáng)陽(yáng)性（棕色）。

1.4 MRGs的相關(guān)性、共表達(dá)、甲基化以及免疫浸潤(rùn)分析 將1.2分析得到的MRGs進(jìn)行相關(guān)性分析，共表達(dá)分析及甲基化分析。GSVA包[8]（v1.34.0）和estimate包[9]（v1.0.13）用來分析精原細(xì)胞瘤RNA-Seq數(shù)據(jù)，評(píng)估精原細(xì)胞瘤患者TME中基質(zhì)細(xì)胞比例和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值范圍0~1，絕對(duì)值小于0.3為弱相關(guān)或不相關(guān)；絕對(duì)值介于0.3~0.5為一般相關(guān)程度；絕對(duì)值介于0.5~0.8為中等程度相關(guān)；絕對(duì)值大于0.8為強(qiáng)相關(guān)。

1.5 生存分析Survival包（v3.2-10）用來進(jìn)行生存資料的統(tǒng)計(jì)分析，survminer包（v0.4.9）用于生存數(shù)據(jù)的可視化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理R（v3.6.3）用于數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析與可視化。由Pearson秩和檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。生存數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法為Cox回歸。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs與MRGs分析結(jié)果 對(duì)精原細(xì)胞瘤RNA-seq數(shù)據(jù)分析后，共注釋出56 493個(gè)基因，其中編碼mRNA 19 577個(gè)，lnRNA 14 077個(gè)，miRNA 1 448個(gè)。滿足差異基因篩選條件的mRNA編碼基因共有1 865個(gè)，其中上調(diào)基因1 462個(gè)，下調(diào)基因403個(gè)（圖1A）。去除GSEA下載的6組脂代謝相關(guān)基因集中的重復(fù)基因后獲得691個(gè)脂代謝相關(guān)基因，與DEGs取交集后共有65個(gè)MRGs，見圖1B。MRGs FABP1的log2（FC）=5.96，P.adj=1.63E-27，差異倍數(shù)與P值極為顯著；FABP1在Ⅱ/Ⅲ期精原細(xì)胞瘤中有著明顯的表達(dá)差異（P＜0.001，圖1C）；免疫組化結(jié)果顯示FABP1在高級(jí)別精原細(xì)胞瘤中有著更高的表達(dá)水平（圖1D）。

圖1 DRGs和MRGs的差異表達(dá)基因篩選Fig 1 Differential expression genes screening in DRGs and MRGs

2.2 FABP1與MRGs的相關(guān)性、共表達(dá)及甲基化分析 從MRGs中篩選出差異顯著上調(diào)基因堿性鞘磷脂酶（ENPP7）、載脂蛋白A2（APOA2）、磷脂酶A2 XII B（PLA2G12B）、載脂蛋白B（APOB）、載脂蛋白A4（APOA4）、細(xì)胞色素P450 2W1（CYP2W1）、載脂蛋白H（APOH）、載脂蛋白C3（APOC3）、二?；视图っ甫剩―GKK）和下調(diào)基因超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶3（ELOVL3）、二?；视蚈-酰基轉(zhuǎn)移酶2樣蛋白6（DGAT2L6）、二?；视蚈-?；D(zhuǎn)移酶2樣蛋白4（DGAT2L4、AWAT2）、甘油激酶2（GK2），相關(guān)性分析結(jié)果顯示FABP1與各基因均有顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.01，圖2A）。精原細(xì)胞瘤樣本中FABP1與上調(diào)MRGs共表達(dá)分析結(jié)果按照相關(guān)性強(qiáng)弱進(jìn)行排序，F(xiàn)ABP1與各基因均有顯著的共表達(dá)關(guān)系（P＜0.001，圖2B）；除APOB和APOA4和FABP1有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系外，其余各指標(biāo)均與FABP1有中等相關(guān)強(qiáng)度；熱圖顯示在低表達(dá)FABP1的精原細(xì)胞瘤樣本中，各指標(biāo)的表達(dá)低，高表達(dá)FABP1樣本中各指標(biāo)的表達(dá)高，顯示出表達(dá)的一致性。下調(diào)MRGs的DNA甲 基 化 分 析 表 明 除 了GK2，ELOVL3、DGAT2L6、AWAT2在不同的甲基化探針中均存在較高程度的DNA甲基化（P＜0.001，圖3）。

圖3 表達(dá)下調(diào)的MRGs在不同甲基化探針中的甲基化水平Fig 3 Methylation levels of down-regulated MRGs in different methylation probes

2.3 FABP1的免疫浸潤(rùn)分析24種免疫細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果表明，F(xiàn)ABP1的表達(dá)與自然殺傷（NK）細(xì)胞、NK CD56 bright細(xì)胞、肥大細(xì)胞、γδ（gamma-delta，Tgd）T細(xì)胞、未成熟樹突狀（iDC）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀（DC）細(xì)胞存在顯著正相關(guān)（P＜0.01，圖2C），其中與NK細(xì)胞，NK CD56 bright細(xì)胞存在中等強(qiáng)度以上相關(guān)；FABP1和NK CD56dim bright細(xì)胞、活化樹突狀（aDC）細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、細(xì)胞毒性細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、中央記憶型T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01，圖2C），其中與中央記憶型T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的相關(guān)性強(qiáng)度較強(qiáng)。精原細(xì)胞瘤中與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的結(jié)果顯示高表達(dá)FABP1較低表達(dá)的腫瘤樣本，基質(zhì)得分高，而免疫浸潤(rùn)得分與估計(jì)得分低（圖2D）。

圖2 FABP1與MRGs的相關(guān)性、共表達(dá)以及免疫浸潤(rùn)分析Fig 2 Correlation，co-expression and immune infiltration analysis between FABP1 and MRGs

2.4 生存分析結(jié)果 高FABP1表達(dá)患者的無(wú)進(jìn)展生存期較短。FABP1共表達(dá)脂代謝基因PLA2G12B、APOB、APOA2、APOC3、APOA4和CYP2W1的 生 存 結(jié)果與FABP1一致；而在精原細(xì)胞瘤中低表達(dá)的MRGs如DGAT2L6與AWAT2則顯示相反的生存結(jié)果（P＜0.01，圖4）。

圖4 FABP1與各指標(biāo)高低表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存期比較的生存曲線Fig 4 Survival curve of comparison of progression-free survival time in FABP1 and other genes high-low expression group

3 討論

睪丸生殖細(xì)胞瘤作為15~35歲年輕男性中發(fā)病率較高的實(shí)體惡性腫瘤，因其發(fā)病的特殊性，往往對(duì)該年齡段男性的正常生活造成較大影響，除導(dǎo)致不育外，甚至?xí)够颊弋a(chǎn)生不良預(yù)后而死亡，精原細(xì)胞瘤作為其中重要的類型更應(yīng)給予足夠的關(guān)注[10]。因?yàn)棰衿诰?xì)胞瘤患者具有極佳的生存率，所以為了在精原細(xì)胞瘤進(jìn)展過程中鑒別其有無(wú)向高級(jí)別腫瘤進(jìn)展的傾向，將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅰ期精原細(xì)胞瘤作差異表達(dá)分析篩選出FABP1及相關(guān)脂代謝相關(guān)差異基因。同時(shí)分析了FABP1與MRGs的相關(guān)性與共表達(dá)關(guān)系，MRGs在不同甲基化探針中甲基化的情況，不同表達(dá)的FABP1與腫瘤中免疫細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)關(guān)系以及表達(dá)FABP1與MRGs患者的生存差異。筆者認(rèn)為，F(xiàn)ABP1可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的脂代謝途徑，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力，減弱免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而介導(dǎo)精原細(xì)胞瘤的進(jìn)展。FABP1具有成為鑒別精原細(xì)胞瘤進(jìn)展以及潛在治療靶點(diǎn)的標(biāo)志物的潛力。

細(xì)胞增殖是腫瘤的共性，而腫瘤的轉(zhuǎn)移往往意味著預(yù)后不良，在此過程中，腫瘤細(xì)胞通常具有特征性的脂代謝變化，需要脂肪酸來合成細(xì)胞膜和細(xì)胞活動(dòng)所需的信號(hào)分子[11-12]。Nieman等[13]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4在卵巢癌網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶中較原發(fā)性卵巢癌中表達(dá)增多，作為腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)慕橘|(zhì)，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用。FABP1在Ⅱ期、Ⅲ期精原細(xì)胞瘤中差異表達(dá)升高極為明顯，通過分析FABP1與其MRGs之間的共表達(dá)與相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FABP1與APOB、APOA4、PLA2G12B、APOC3、APOA2、DGKK、CYP2W1、ENPP7共表達(dá)，這些基因編碼蛋白參與脂質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)的傳遞；FABP1與ELOVL3、DGAT2L6、DGAT2L4、AWAT2和GK2呈負(fù)相關(guān)，對(duì)下調(diào)的MRGs進(jìn)行甲基化分析，其中ELOVL3、DGAT2L6、AWAT2有較高的甲基化水平。DAGT可通過增加脂質(zhì)的存儲(chǔ)來減少可用脂質(zhì)[11]。Bagnato等[14]發(fā)現(xiàn)DGAT1在人成纖維細(xì)胞中過表達(dá)可降低其增殖與侵襲性；而ELOVL3則能夠參與形成脂滴、調(diào)控脂類合成以及增強(qiáng)脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化能力[12]。綜上所述，F(xiàn)ABP1可能通過與脂代謝相關(guān)基因共同作用，增強(qiáng)精原細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)脂肪酸攝入的同時(shí)，增加可用脂質(zhì)以及減少脂肪酸氧化，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移能力。

腫瘤免疫微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞周圍存在的免疫細(xì)胞以及具有免疫調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)的總稱，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[15]。腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫耐受以及腫瘤免疫逃逸等[16]。在調(diào)控過程中，腫瘤細(xì)胞不是簡(jiǎn)單地增長(zhǎng)，而是在積極主動(dòng)的調(diào)整自身，與免疫細(xì)胞相互影響，采取各種策略如限制免疫細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來使腫瘤免疫延后、改變乃至完全停止，在晚期腫瘤中，這種機(jī)制會(huì)變得尤其精妙且復(fù)雜[4，17]。同樣，免疫細(xì)胞也會(huì)發(fā)生改變來適應(yīng)腫瘤發(fā)展，例如惡性腫瘤細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞發(fā)生衰老。衰老的T細(xì)胞表現(xiàn)出不平衡的脂代謝。這種不平衡的脂代謝會(huì)改變脂質(zhì)種類和T細(xì)胞中脂滴的積累[18]。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，脂代謝基因FABP1在精原細(xì)胞瘤中具有較高的差異表達(dá)，并可能通過調(diào)節(jié)脂代謝來發(fā)揮特定的作用。這一過程同樣可能發(fā)生在其腫瘤免疫微環(huán)境中。筆者首先通過ssGSEA算法評(píng)估了FABP1與24種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)FABP1樣本中存在更高比例的NK細(xì)胞及NK CD56 bright細(xì)胞浸潤(rùn)；在低表達(dá)FABP1樣本中存在更高比例的輔助性T細(xì)胞與中央記憶型T細(xì)胞浸潤(rùn)。接著利用estimate算法評(píng)估精原細(xì)胞瘤中各成分情況，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)FABP1的腫瘤中基質(zhì)成分升高，這與基質(zhì)細(xì)胞能夠支持腫瘤生長(zhǎng)是一致的；免疫浸潤(rùn)及腫瘤細(xì)胞比例均降低，說明免疫微環(huán)境在精原細(xì)胞瘤不同階段中產(chǎn)生了較大的變化，在Ⅰ期主要以適應(yīng)性免疫細(xì)胞為主，而在Ⅱ、Ⅲ期以固有免疫細(xì)胞為主，且免疫浸潤(rùn)程度顯著降低，F(xiàn)ABP1可能在這一過程中通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝發(fā)揮關(guān)鍵作用，高表達(dá)FABP1的腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性攝取脂肪酸，從而改變精原細(xì)胞瘤的免疫微環(huán)境。

FABP1與相關(guān)MRGs的Kaplan-Meier生存曲線差異顯著，這意味著可以通過針對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)來改善患者預(yù)后，延長(zhǎng)生存時(shí)間。綜上所述，本研究認(rèn)為精原細(xì)胞瘤在進(jìn)展過程中可能發(fā)生脂肪酸代謝重編程，腫瘤細(xì)胞以FABP1為代表與MRGs相互作用，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)運(yùn)輸與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的合成來增強(qiáng)腫瘤的增殖與遷移能力，在此過程中，腫瘤細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性攝取脂肪酸，改變腫瘤免疫微環(huán)境，進(jìn)而降低患者預(yù)后，這為理解FABP1在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮的作用具有一定的啟發(fā)。脂代謝在精原細(xì)胞瘤細(xì)胞中的具體機(jī)制，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，探索FABP1作為潛在的診斷標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)在其中發(fā)揮的具體作用以及其與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系，為精原細(xì)胞瘤的發(fā)生進(jìn)展提供理論依據(jù)。