HDAC1、MAPK水平與慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者糖皮質(zhì)激素抵抗的關(guān)系

劉春苗，牛春生，楊強(qiáng)

（天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院，天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科，天津 301800）

慢性鼻-鼻竇炎（CRS）是一種發(fā)生于鼻腔及鼻竇黏膜的慢性炎癥疾病，慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）是CRS較為嚴(yán)重的一種，可引發(fā)嚴(yán)重的頭痛、流涕、嗅覺喪失、鼻塞等癥狀，對患者生活質(zhì)量和身體健康具有較大影響[1]。糖皮質(zhì)激素（GC）是臨床治療CRSwNP的首選抗炎藥物，對改善患者臨床癥狀療效較好，但部分患者對GC治療不敏感，臨床稱之為GC抵抗，GC抵抗的發(fā)生會直接影響GC的治療效果，因此，了解影響GC抵抗發(fā)生的危險因素具有重要臨床意義[2-3]。組蛋白去乙?；福℉DACs）屬于去乙?；赋易?，組蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）是HDACs中研究較多的一種，其水平的高低可反映組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）和HDAC的動態(tài)平衡，HDACs主要分布于細(xì)胞核中，參與機(jī)體炎癥，可通過調(diào)節(jié)核因子（NF）-κB信號通路、Toll樣受體4（TLR4）-MyD88信號通路發(fā)揮抗炎作用，其中組蛋白修飾是重要組成成分，組蛋白乙?；?去乙酰化與基因活化密切相關(guān)[4]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun N末端蛋白激酶（JNK）、p38MAPK 3個亞型，其信號通路主要存在于細(xì)胞內(nèi)，可將細(xì)胞外的刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，參與細(xì)胞炎癥、增殖、轉(zhuǎn)化、分化及凋亡等多種生物學(xué)反應(yīng)[5]。段甦等[6]通過RT-PCR及免疫組化染色檢查發(fā)現(xiàn)HDAC1 mRNA及蛋白表達(dá)在鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻息肉中表達(dá)上調(diào)。同時王彤等[7]對單純CRS及CRSwNP患者M(jìn)APK信號通路進(jìn)行檢測，顯示MAPK通路對鼻黏膜上皮細(xì)胞增殖作用在CRS中減弱。近年來有研究指出，HDAC1和MAPK在臨床中存在一定相關(guān)性[8]，因此筆者探討HDAC1、MAPK信號傳導(dǎo)通路中ERK、JNK、p38MAPK水平在預(yù)測CRSwNP患者GC抵抗中的價值。

1 對象與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月—2020年10月收治的CRSwNP患者60例，根據(jù)患者是否存在GC抵抗分為GC抵抗組（n=22）和GC敏感組（n=38），其中GC抵抗組男12例，女10例；年齡25~69歲，平均年齡（38.45±2.31）歲；體重指數(shù)（BMI）為19~26 kg/m2，平均BMI（23.56±2.10）kg/m2；GC敏感組男21例，女17例；年齡25~68歲，平均年齡（38.15±2.05）歲；BMI為19~26 kg/m2，平均BMI（23.91±2.34）kg/m2。性別、年齡、BMI兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。已獲院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2018-7號）。診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《慢性鼻-鼻竇炎診斷治療指南》[9]中CRSwNP診斷標(biāo)準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合CRSwNP診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）年齡≥18歲。（3）入組前3個月未接受GC治療。（4）簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）變應(yīng)性鼻炎。（2）免疫缺陷者。（3）合并嚴(yán)重肝、肺、腎及心血管疾病。

1.2 方法（1）GC抵抗標(biāo)準(zhǔn)：鼻內(nèi)鏡下鉗夾活檢法取治療前組織標(biāo)本。給予甲潑尼龍（天津天藥藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20020224）口服，劑量為24 mg/次，1次/d，持續(xù)治療1周后取鼻息肉組織作為GC治療后的樣本。對比治療前后樣本，采用鼻內(nèi)鏡下息肉Lured-Kennedy改良鼻內(nèi)鏡評分[8]評估患者對GC治療的反應(yīng)，Lured-Kennedy共評估6項，每項0~2分，總分為12分，其中Lured-Kennedy評分改善≥1分為GC敏感，否則為GC抵抗。（2）mRNA檢測：常規(guī)Trizol（購自美國Invitrogen公司）提取總細(xì)胞中RNA，以熒光實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（VQ-RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄cDNA測定HDAC1 mRNA。VQ-RT-PCR反應(yīng)體系：5×定量PCR緩沖液10 μL，上游引物、下游引物、熒光探針各（10 pmol/μL）1 μL，ddH2O 30 μL，cDNA 5 μL，Taq酶（2 U/μL）1.5 μL，總體積：50 μL。反應(yīng)條件：3 min 93℃，45 s 93℃，45 s 55℃，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由計算機(jī)對熒光信號進(jìn)行處理并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本結(jié)果以相對循環(huán)閾值法由計算機(jī)讀出。VQ-RT-PCR試劑盒由德國Qiagen公司提供，以Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，采用β-actin和GA PDH進(jìn)行雙內(nèi)參校正。HDAC1引物和探針由美國ABI公司設(shè)計合成，治療前后測定。MAPK相關(guān)指標(biāo)測定：取GC治療前、后的鼻息肉組織，采用VQ-RT-PCR檢測p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA表達(dá)量，測定流程同HDAC1 mRNA。VQ-RT-PCR引物序列表見表1。

表1 VQ-RT-PCR引物序列表Tab 1 VQ-RT-PCR primer sequence list

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 選用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用Kolmogorov-Smirnov法檢驗正態(tài)性，正態(tài)分布資料按±s表示，兩兩比較行t檢驗；偏態(tài)分布資料采用中位數(shù)[M（Q1～Q3）]表示，兩兩比較行秩和檢驗；計數(shù)資料以（%）表示，組間行χ2檢驗；利用受試者工作特征（ROC）曲線分析HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA對CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的預(yù)測價值，多因素分析采取非條件Logistic逐步回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA水平比較 治療前兩組各指標(biāo)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。治療后GC抵抗組HDAC1 mRNA表達(dá)量顯著低于GC敏感組，p38MAPK、ERK、JNK mRNA表達(dá)量顯著高于GC敏感組（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA比較（±s）Tab 2 Comparison of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA between the two groups（±s）

表2 兩組HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA比較（±s）Tab 2 Comparison of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA between the two groups（±s）

注：GC：糖皮質(zhì)激素；HDAC1：組蛋白去乙酰化酶1；p38 MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；ERK：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶；JNK：c-Jun N末端蛋白激酶

GC敏感組（n=38）HDAC1 治療前 0.33±0.02 0.34±0.04治療后 0.55±0.03 0.84±0.07 p38 MAPK治療前 0.74±0.07 0.76±0.06項目 時點 GC抵抗組（n=22）t P 0.279 0.000 0.247治療后 0.56±0.04 0.32±0.05 19.213 0.000 ERK 治療前 0.91±0.07 0.93±0.08 0.975 0.333治療后 0.78±0.06 0.51±0.05 18.721 0.000 JNK 治療前 0.89±0.07 0.87±0.06 1.170 0.247治療后 0.67±0.08 0.34±0.05 19.694 0.000 1.093 18.425 1.170

2.2 HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預(yù)測CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的ROC曲線分析 經(jīng)ROC曲線分析，HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預(yù) 測CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的曲線下面積分別為0.715、0.917、0.863、0.885，均P＜0.05，見表3。HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預(yù)測CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的ROC曲線見圖1。

表3 HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預(yù)測CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的ROC分析Tab 3 ROC analysis of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA predicting the occurrence of GC resistance in patients with CRSwNP

圖1 HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA預(yù)測CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的ROC曲線Fig 1 ROC curve of HDAC1 mRNA,p38MAPK mRNA,ERK mRNA and JNK mRNA predicting the occurrence of GC resistance in patients with CRSwNP

2.3 CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 將有差異的單因素納入Logistic模型，行量化賦值，因變量為是否發(fā)生GC抵抗（是=1，否=0），自變量為HDAC1 mRNA（＜0.660=1，≥0.660=0）、p38MAPK mRNA（≥0.428=1，＜0.428=0）、ERK mRNA（≥0.571=1，＜0.571=0）、JNK mRNA（≥0.510=1，＜0.510=0）。經(jīng)多因素Logistic回歸分析證實，HDAC1 mRNA＜0.660、p38MAPK mRNA≥0.428、ERK mRNA≥0.571、JNK mRNA≥0.510是CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的危險因素，均P＜0.05，見表4。

表4 CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的多因素Logistic回歸分析Tab 4 Multivariate Logistic regression analysis of GC resistance in patients with CRSwNP

3 討論

GC的抗炎效果由糖皮質(zhì)激素受體（GR）介導(dǎo)，GR主要有GRα和GRβ兩種亞型，GRα含量在鼻黏膜中遠(yuǎn)大于GRβ，其中GRα活化后可與GC結(jié)合產(chǎn)生GR-GC復(fù)合物，復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中以同源二聚體形式與靶基因中GC反應(yīng)元件結(jié)合，在其他輔助因子參與下改變靶基因染色體，使其發(fā)生重構(gòu)并激活靶基因轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮抗感染、抗炎、抑制免疫等生物學(xué)效應(yīng)[10-11]。而GRβ無法與GC結(jié)合，但可競爭性與GRα結(jié)合生成異源二聚體來減少GR-GC復(fù)合物的產(chǎn)生，同時抑制GRα活性，以此降低GC的抗炎效果，因此，GRα/GRβ比值降低是GC抵抗發(fā)生的重要原因[12]。另外，GR可與其他轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、活化蛋白1（AP-1）相互作用，抑制炎性基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎癥因子產(chǎn)生[13]。

本研究中，GC抵抗組HDAC1 mRNA顯著低于GC敏感組，p38MAPK、ERK、JNK mRNA表達(dá)量顯著高于GC敏感組，提示上述因素可能是導(dǎo)致CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的影響因素。組蛋白乙酰化由HAT和HDAC共同調(diào)節(jié)，當(dāng)機(jī)體HDAC1表達(dá)量下降，HAT和HDAC動態(tài)平衡被打破，組蛋白過乙酰化，致使細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄增多，炎癥蛋白合成增加，阻斷了GC抗炎效果[14-15]；HDAC1表達(dá)量下降還可使去乙酰化的NF-κB乙?；?，激發(fā)NF-κB活性，導(dǎo)致活化的GC與GRα結(jié)合的反應(yīng)元件能力下降，使GC抗炎作用下降，從而引發(fā)GC抵抗[16-17]。

MAPK信號通路可參與上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與GR亞型的合成，使GRα/GRβ比值發(fā)生改變，促使GC抵抗發(fā)生[18]。同時MAPK信號通路被不同的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)刺激激活，如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，因此MAPK信號通路可以此調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥、應(yīng)激、分化、生長等病理和生理過程[19]。MAPK信號通路可被細(xì)菌病原體、促炎因子等激活，激活后的MAPK信號通路可從脂質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，促使NF-KB活化，并調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)來參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，促使促炎因子如白介素、腫瘤壞死因子α等產(chǎn)生，誘發(fā)GC抵抗[20]。

經(jīng)多因素Logistic回歸分析及ROC分析證實，HDAC1 mRNA＜0.660、p38MAPK mRNA≥0.428、ERK mRNA≥0.571、JNK mRNA≥0.510是CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的危險因素。因此，采用GC對CRSwNP患者進(jìn)行治療時，臨床需對上述因素予以關(guān)注，異常者及時采取相應(yīng)措施，降低GC抵抗發(fā)生。

綜上，CRSwNP患者GC抵抗發(fā)生的機(jī)制較為復(fù)雜，HDAC1及MAPK可直接或間接參與機(jī)體許多生理反應(yīng)過程，在GC抵抗發(fā)生中起重要作用。