高效液相色譜法檢測植物油中雙酚A含量方法研究

柳永英，蔣文佳，胡 蓉，伍先紹

（廣西壯族自治區(qū)糧油質量檢驗中心，廣西 南寧 530034）

雙酚A（bisphenol A，BPA），學名為2,2-二對羥基苯基丙烷，可用于制造環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯、聚酚氧等多種高分子材料，被大量應用于食品塑料包裝制品中，如飲用水瓶、植物油瓶、嬰兒奶瓶等[1]。雙酚A是脂溶性物質，在用于儲存食品過程中，容易遷移到食品中，其毒性受到各國普遍關注。經科學家多年的毒理研究，發(fā)現(xiàn)其進入人體后，能影響內分泌、生殖和神經系統(tǒng)以及產生促癌等不良作用，特別是嬰幼兒，可能導致嬰兒荷爾蒙分泌異常和胸部發(fā)育障礙[1-2]，對消費者，特別是嬰幼兒人群，存在著潛在的危害。因此，各國對于雙酚A在食品包裝材料中的使用進行了規(guī)范。2018年，歐盟發(fā)布法規(guī)（EU）2018/213規(guī)定食品接觸材料中的雙酚A的遷移限量為 0.05 mg/kg[3]，其中嬰幼兒食品、特殊醫(yī)療用途食品、嬰兒配方奶粉等專門針對嬰幼兒的產品的接觸清漆或涂層材料和塑料物品不得含有雙酚A。歐盟認為含有雙酚A的奶瓶會誘發(fā)性早熟，從2011年3月2日起，禁止生產含有雙酚A的嬰兒奶瓶。含有雙酚A的熱敏紙在部分發(fā)達國家已經禁止使用。雙酚A也已被列入歐洲化學品管理局高度關注物質候選清單。此外，2018版OEKO-TEX? Standard100（世界上最權威的紡織品生態(tài)標簽）也將雙酚 A列入受限物質。2021年5月30日，我國衛(wèi)生部等六部門下達禁令，禁止雙酚A用于嬰幼兒奶瓶中。為此我國出臺《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》（GB 9685—2016），明確規(guī)定雙酚 A用于食品接觸塑料、涂料、粘合劑時，其特定遷移量應不超過0.6 mg/kg[4]。

目前，我國食用植物油產品包裝容器主要為塑料容器，為了有效監(jiān)測塑料容器可能對食用植物油儲存帶來的風險，我國將植物油中雙酚A的風險評估監(jiān)測列入國家計劃，經監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)植物油中雙酚A也有被檢出的情況。但是，目前我國沒有制定檢測食用植物油中雙酚A含量的國家標準或行業(yè)標準，影響植物油中雙酚A風險評估的科學評價?，F(xiàn)有相關雙酚A檢測國家標準有《食品安全國家標準 水產品中辛基酚、壬基酚、雙酚A、已烯雌酚、雌酮、17烯雌乙炔雌二醇、17雌二雌二醇、雌三醇殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》（GB 31660.2—2019），《化妝品中污染物雙酚 A的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法》（GB/T 30939—2014），《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品2, 2-二（4-羥基苯基）丙烷（雙酚A）遷移量的測定》（GB 31604.10—2016），《食品接觸材料 高分子材料 食品模擬物中 2,2-二（4-羥基苯基）丙烷（雙酚A）的測定 高效液相色譜法》（GB/T 23296.16—2009），《化妝品中污染物雙酚A 的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法》（GB/T 30939—2014）《出口化妝品中雙酚 A的測定 液相色譜熒光檢測法》（SN/T 3822—2014），這些標準方法均不適用植物油中雙酚 A的檢測。

針對上述問題，本研究根據雙酚A的特性，經查尋比對相關文獻資料，提出采用高效液相色譜法檢測植物油中雙酚A含量方法，通過試驗研究確定最優(yōu)的檢測條件，同時依據《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017），對植物油中雙酚 A含量的測定方法進行確認試驗[5-6]。

1 材料和方法

1.1 設備和材料

Agilent 1260系列高效液相色譜儀（配有熒光檢測器）：安捷倫科技（中國）有限公司；高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；多管渦旋振蕩器：萊普特科學儀器有限公司；水浴氮吹儀：上海旦鼎貿易有限公司；氨基固相萃取柱（500 mg，3 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

雙酚A標準物質，純度為99.8%：中國計量科學研究院；乙腈（色譜級）、二氯甲烷（色譜級）、甲酸（色譜級）、甲醇（色譜級）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；實驗用水為一級水。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

0.1%甲酸水溶液：吸取1 mL甲酸于1 000 mL容量瓶，加水定容，混勻后超聲備用。

乙腈-0.1%甲酸水溶液（43+57，體積比）：取430 mL乙腈和570 mL 0.1-%甲酸水溶液，混勻。

1.2.2 標準溶液配制

雙酚 A標準儲備溶液：準確稱取 0.016 7 g的雙酚A標準品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。折算雙酚A固體標準物質的純度99.8%，實際配制標準儲備溶液濃度為 666.7 μg/mL。在0～4 ℃下避光保存，有效期為6個月。

雙酚 A標準中間儲備溶液：準確移取666.7 μg/mL的雙酚 A標準儲備溶液 1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解，再定容至刻度，配制成6.667 μg/mL雙酚A標準工作溶液。在0～4 ℃下避光保存，有效期為2周。

1.2.3 儀器分析條件和前處理方法

1.2.3.1 儀器色分析條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱，長250 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm；流動相B相：乙腈，A相：0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，使用前過濾并脫氣；梯度洗脫條件：43% B（0～10 min），43%～100% B（10～12 min），100%～43% B（12～ 15 min），43% B（15～23 min）；柱溫：40 ℃；熒光檢測器：激發(fā)波長 230 nm；發(fā)射波長：313 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：50 μL。

1.2.3.2 前處理方法 稱取1 g（精確至0.000 1 g）試樣于15 mL具塞玻璃離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋振蕩5 min，在15 ℃下離心3 min（轉速4 000 r/min），立即吸取上清液，收集于50 mL濃縮瓶中，試樣中再加2次5 mL乙腈，分別重復上述渦旋提取步驟，合并3次上清液，于40 ℃旋轉蒸發(fā)至近干，準確加入10 mL二氯甲烷溶解殘渣，待凈化。分兩次準確移取試樣提取液，每次2.5 mL，過氨基固相萃取柱，待樣品溶液流完后，用二氯甲烷5 mL分兩次淋洗固相萃取柱，棄去所有流出液，最后用乙腈7 mL分兩次洗脫，用10 mL玻璃比色管收集洗脫液，40 ℃氮吹濃縮至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解殘留物，過0.22 μm有機微孔濾膜，收集濾液于進樣瓶中，供高效液相色譜檢測。

1.3 數(shù)據分析

通過色譜條件的優(yōu)化、提取次數(shù)、洗脫體積優(yōu)化，找出最佳色譜條件和樣品前處理方法，在依據GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》進行方法確認，所有數(shù)據結果均按該標準附錄A中要求進行評價分析。本實驗中均應用Microsoft Excel進行數(shù)據處理和圖表繪制，色譜圖和標準曲線圖均為Agilent 1260高效液相色譜儀操作軟件導出圖。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

取植物油空白樣品，通過加標回收試驗的方式，對比空白樣品和加標樣品的色譜圖，調節(jié)流動相比例，要求雙酚A出峰處無干擾峰，且雙酚A與其他峰的分離度達到1.5，再確定最佳的流動相比例。經多種條件試驗，確定流動相為乙腈/0.1%甲酸水溶液梯度洗脫為最優(yōu)的流動相條件，其中乙腈梯度為：43%（0～10 min），43%～100%（10～12 min），100%～43%（12～15 min），43%（15～23 min），色譜圖見圖1，出峰時間合適，目標物無干擾鋒，分離度好。

圖1 流動相梯度洗脫的色譜圖Fig.1 Chromatogram of gradient elution of mobile phase

2.2 提取次數(shù)的優(yōu)化

參考國家標準GB 9685—2016中食品材料雙酚 A的遷移限量為 0.6 mg/kg的規(guī)定，選擇0.667 mg/kg加標濃度，考察不同提取次數(shù)時雙酚A的回收率結果，以回收率的大小來確定最優(yōu)提取次數(shù)，測定結果見表1，經比較檢測結果，確定最優(yōu)提取次數(shù)為3次。

表1 不同提取次數(shù)的回收率測定結果Table 1 Determination results of recovery rates of different extraction times %

2.3 洗脫體積的選擇

選擇0.667 mg/kg加標濃度，考察5、7、10 mL不同體積乙腈洗脫氨基固相萃取柱時，雙酚A的回收率情況，以回收率的大小來確定最佳洗脫液體積，測定結果見圖2，經比較檢測結果，確定最優(yōu)洗脫液體積為7 mL。

圖2 不同洗脫液體積的回收率測定結果Fig.2 Determination results of recovery rates of different eluent volume

2.4 方法學性能考察

2.4.1 線性范圍和相關系數(shù)

采用外標法配制標準曲線進行定量分析。配制8個標準曲線點，繪制的標準曲線見圖3，濃度分別為 0.003 33、0.006 67、0.013 33、0.033 33、0.066 67、0.133 30、0.333 30、0.666 70 μg/mL，線性范圍為0.003 33～0.666 70 μg/mL，相關系數(shù)為1，線性相關性良好。

圖3 雙酚A標準曲線Fig.3 Bisphenol A of the standard curve

2.4.2 方法檢出限

將雙酚A標準溶液進行逐級稀釋，測定其響應值，選擇信噪比值在2～3的范圍的濃度點進行方法檢出限確認，確定濃度點為0.006 67 μg/mL，再通過空白樣品加標方式進行確證。將其與空白樣品的測量信號進行比較，確定達到或接近2倍信噪比響應值的可靠含量，再將該含量減小一倍進行加標試驗，能達到2倍信噪比的概率應小于50%，該可靠含量即確證為方法檢出限，測定結果見表2，確證方法檢出限為0.007 mg/kg。

表2 方法檢出限測定結果Table 2 Determination results of the detection limit

2.4.3 方法定量限

在空白樣品中按 2倍方法檢出限（即0.013 3 mg/kg）的添加量進行加標實驗，確證方法定量限，平行測定6次，計算6次測定結果的回收率和變異系數(shù)，根據 GB/T 27417—2017中附錄A和附錄B的要求，加標量小于0.1 mg/kg的范圍，回收率要求范圍為60%～120%，精密度要求小于 15%，6次測定回收率范圍為 92.6%～100.2%，詳見表3。

表3 方法定量限測定結果Table 3 Determination results of the quantification limit

2.4.4 方法正確度

在空白樣品中加入適量雙酚A標準溶液進行加標回收實驗，添加濃度水平分別為 0.033 3、0.333 3、0.667 0 mg/kg，每個點測定3次，計算回收率和變異系數(shù)，測定結果見表4。根據GB/T 27417—2017中附錄A和附錄B的要求，0.033 3、0.333 3、0.667 0 mg/kg回收率范圍要求分別為60%～120%、80%～110%、80%～110%，精密度要求范圍分別為小于15%、小于11%、小于11%，確定三個濃度水平的方法正確度均滿足要求。

表4 方法正確度測定結果Table 4 Determination results of the accuracy

2.4.5 方法精密度

選擇0.033 3 mg/kg進行方法精密度驗證，重復測定7次，計算其平均值和變異系數(shù)，測定結果見表5。結果表明，重復7次回收率結果滿足GB/T 27417—2017中附錄B中要求，回收率要求范圍為60%～120%，精密度要求小于15%。經驗證，7次測定回收率范圍為92.6%～103.2%，平均回收率為99.1%，變異系數(shù)為2.8%，確定方法精密度滿足要求。

表5 方法精密度測定結果Table 5 Determination results of the precision

2.4.6 不同種類植物油的正確度確認

不同種類植物油空白樣品的加標含量水平均為0.333 mg/kg，通過回收率結果進行評價，要求回收率范圍在80%～110%，且平行試驗的相對相差均小于 11%，測定結果見表6。結果表明，在0.333 mg/kg含量水平，對于不同種類植物油的回收率和相對相差結果均符合要求，本方法正確度均能滿足要求。

表6 不同種類植物油正確度測定結果Table 6 Results of accuracy determination of different vegetable oils

3 結論

本研究在優(yōu)化檢測條件的基礎上，建立了高效液相色譜法檢測植物油中雙酚A含量的方法。經方法性能學考察，方法檢出限為0.007 mg/kg，定量限為0.013 mg/kg，7次重復測定結果的變異系數(shù)為 2.8%，方法的回收率范圍為 90.8%～103.2%。結果表明，該方法滿足植物油中雙酚A含量測定需要，檢測成本低，適應范圍廣，前處理設備簡單且易操作，可為檢測植物油中雙酚A含量方法的建立以及監(jiān)管實施和評價提供技術參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http//lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數(shù)據庫下載獲取。