固相萃取法提取典型海水溶解有機(jī)質(zhì)及其紅外光譜和固態(tài)13C 核磁共振表征*

武奕鑫 王孝聰,2, 周振淞 何 晨 潘良浩 宋桂雪①

(1. 山東大學(xué)(青島)海洋研究院 山東青島 266237; 2. 中國(guó)石油大學(xué)(北京)理學(xué)院 北京 102249; 3. 中國(guó)石油大學(xué)(北京)重質(zhì)油國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 102249; 4. 廣西科學(xué)院廣西紅樹林研究中心 廣西北海 536000)

海水中可通過0.45 μm 濾膜的天然有機(jī)物被定義為溶解性有機(jī)質(zhì)(dissolved organic matter, DOM)。DOM 是海洋有機(jī)碳庫(kù)的主體組分(＞95%) (Hansellet al, 2013), 在海洋生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用。海洋中大量的DOM 分子耐受生物降解, 周期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)千年, 被稱為惰性有機(jī)質(zhì)(refractory DOM,rDOM)。微型生物碳泵(microbial carbon pump, MCP)理論框架提出海洋中的活性DOM 可以通過微型生物代謝活動(dòng)被轉(zhuǎn)化為rDOM, 是研究海洋碳匯的基礎(chǔ)(蔡阮鴻等, 2021), 研究DOM 和rDOM 分子組成及有機(jī)分子結(jié)構(gòu)有助于深入理解海洋碳匯過程及形成機(jī)制和生物效應(yīng)。但由于DOM 是由成千上萬(wàn)個(gè)分子組成的復(fù)雜天然有機(jī)質(zhì)混合物, 解析其結(jié)構(gòu)和分子組成一直是個(gè)難題和巨大挑戰(zhàn)(Arakawaet al, 2017;Zhanget al, 2018a)。

海水中DOM 含量低(0.5～2.0 mg C/L), 化學(xué)成分復(fù)雜、鹽度高(30～35), 受海水DOM 提取技術(shù)的限制,常見分析海水有機(jī)質(zhì)的方法有海水總碳總氮分析、紫外可見光譜(UV-vis)、三維熒光光譜(EEM)、分子排阻色譜(HP-SEC-TOC)、同位素分析(δ13C 和Δ14C)、溶解氨基酸等。但大多分析技術(shù)只能對(duì)DOM 整體組成、光敏成分(如有色溶解性有機(jī)質(zhì) chromophore DOM, cDOM; 熒光溶解性有機(jī)質(zhì)fluorescent DOM,fDOM)的大概類別及其初步來源等信息進(jìn)行分析,想得到分子水平的組成和分子有機(jī)結(jié)構(gòu)等儀器表征信息, 還需借助超高分辨率質(zhì)譜和核磁共振波譜(NMR)等最先進(jìn)的分析技術(shù)(Songet al, 2018; Liet al,2019), 這些表征技術(shù)均需要大量的DOM 樣品。此外,不同實(shí)驗(yàn)室間的分析比對(duì)、微生物培養(yǎng)等也需要克級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品的DOM 樣品, 這就需要高效富集提取出純度高(低鹽分)且性質(zhì)穩(wěn)定的DOM 固體樣品。

自20 世紀(jì)70 年代末開始采用XAD 系列大孔樹脂提取地表水DOM 以來, 研究人員陸續(xù)開發(fā)了超濾法(ultrafiltration, UF)、電滲析耦合反滲透法(reverse osmosis/electrodialysis, RO/ED) 以及固相萃取法(solid-phase extraction, SPE)等富集提取技術(shù)(Greenet al, 2015)。相較于其他固相萃取如C18)富集方法, Bond Elut PPL 樹脂(安捷倫, 經(jīng)修飾的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)固相萃取法在海水DOM 分析中的應(yīng)用最為廣泛。Dittmar 等(2008)曾比較6 種固相萃取樹脂對(duì)海水 DOM 的富集效果, 結(jié)果表明 PPL 固相萃取(PPL-SPE)法更具有代表性, 且提取效率不隨鹽度變化降低, 此外該樹脂還適用于其他水體環(huán)境(Chenet al, 2016; Liet al, 2016)。將SPE 小柱方法擴(kuò)大, 使用填充PPL (500 g)定制樹脂(玻璃柱)處理大體積海水已有報(bào)道(Greenet al, 2014), 但該方法的一些關(guān)鍵參數(shù)對(duì)回收率的影響未見報(bào)道。

基于PPL 小柱富集DOM 的原理, 本文進(jìn)行了海水PPL-DOM (通過PPL 樹脂提取的DOM)富集放大實(shí)驗(yàn), 搭建了小型自動(dòng)化兩級(jí)過濾、調(diào)酸、樹脂柱提取富集裝置, 完善了提取純化工藝; 同時(shí), 本文測(cè)試了PPL 樹脂長(zhǎng)期使用的穩(wěn)定性、重復(fù)性, 研究了上樣速率、洗脫體積等影響參數(shù)。應(yīng)用該技術(shù)提取2 個(gè)近岸表層海水和1 個(gè)紅樹林濕地潮溝水等多個(gè)批次水樣的DOM, 裝置均運(yùn)行可靠, 方法回收率穩(wěn)定。同時(shí)本文使用元素分析、熒光分析、紅外光譜、固態(tài)13C 核磁共振儀分析了樣品基本成分和結(jié)構(gòu)特征, 證明所提取樣品的可靠性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 水樣信息

鰲山灣表層海水: 夏季批次, 2019 年8 月1～8 日,青島鰲山灣北灣(36°22′55″N, 120°49′35″E); 秋冬春季批次, 分別于2020 年10 月7～21 日、2020 年12月3～28 日和2021 年4 月1～20 日在鰲山灣南灣(36°20′03″N, 120°42′27″E)采集; 威海市桑溝灣貝藻養(yǎng)殖區(qū)表層海水(采樣點(diǎn)以海帶養(yǎng)殖為主): 2021 年6月26 日采集, 位置37°05′51″N, 122°34′40″E。海水用聚乙烯水桶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。紅樹林濕地潮溝水:2021 年5 月7～12 日, 位置為北海市峒尾紅樹林自然保護(hù)小區(qū)落潮潮溝(21°29′47″N, 108°59′44″E)。潮溝水樣采集后立即在廣西紅樹林研究中心處理。提取富集裝置流程圖見圖1。

1.2 DOM 提取流程

DOM 提取的自動(dòng)化裝置包括過濾、泵送、調(diào)酸、樹脂柱吸附以及流出液酸堿中和等系統(tǒng), 以及DOM的洗脫、濃縮、純化和凍干過程(圖1)。

圖1 DOM 提取、富集和凍干流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the procedure of DOM extraction, purification and freeze-drying

提取流程包括: (1) 樹脂活化: 中壓玻璃層析柱(高50 cm, 內(nèi)徑5 cm)填裝200 g 新購(gòu)Bond Elut PPL樹脂[柱床高度30 cm, 柱體積(BV) 600 mL]后, 3 倍柱體積(用3 BV 表示, 下文同)甲醇(色譜純)活化和3倍柱體積酸化水(優(yōu)級(jí)純鹽酸酸化的超純水, pH 2.0)淋洗。

(2) 過濾和上樣(步驟1～3): 精密蠕動(dòng)泵(BT100-2J,保定蘭格恒流泵有限公司)泵送水樣過孔徑5 μm 聚乙烯熔噴棉濾芯凈水過濾器和混合纖維素酯濾膜(MCE,孔徑0.45 μm, 美國(guó)默克公司), 管線中水樣與0.1 mol/L稀鹽酸在線調(diào)節(jié)(混合瓶)酸化海水pH至2.0, 隨后水樣中的極性有機(jī)分子經(jīng)PPL 樹脂柱后被吸附, 流出液與堿液中性后排放。

(3) 脫鹽、干燥、洗脫和旋蒸(步驟4～7): 吸附完成后的樹脂柱用pH 值為2.0 的水淋洗除去樹脂中的絕大多數(shù)鹽分, 將柱子在真空干燥器(45 °C)干燥, 再使用高純氮(＞99.999%)徹底吹干樹脂。最后干燥后的樹脂經(jīng)甲醇(3～4 BV)洗脫得黃色洗脫液, 再經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40 °C)去除大部分甲醇近干(剩約20～30 mL),殘余甲醇用氮?dú)獯蹈? 加少量水稀釋混勻后凍干得淡黃色粉末狀PPL-DOM。

(4) 樹脂清洗: 洗脫后的PPL 樹脂使用甲醇(約15 BV)進(jìn)行淋洗, 初步清洗(0～8 BV)可使用重蒸甲醇,最后使用色譜純甲醇(約7 BV)完成樹脂清洗, 若后續(xù)處理樣品為深遠(yuǎn)海的低溶解有機(jī)碳(dissolved organic carbon, DOC)濃度海水, 建議整個(gè)清洗過程均使用色譜純甲醇進(jìn)行清洗。清洗后的樹脂可使用高純氮吹干其中甲醇, 用于下一批次水樣的處理。

1.3 分析儀器與方法

1.3.1 DOC 測(cè)定 總有機(jī)碳分析儀(Shimadzu TOC-L, 日本)測(cè)定水樣DOC, 測(cè)定DOC 前需在約30 mL 樣品中添加40 μL 磷酸(85%～90%, HPLC 級(jí))清除樣品中的無(wú)機(jī)碳。

1.3.2 甲醇洗脫液中DOC 濃度的估算 紫外分光光度計(jì)(Shimadzu UV2700, 日本)測(cè)定PPL-DOM 甲醇溶液中DOM 濃度; 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制: 取已知碳含量PPL-DOM (碳含量46.7%)復(fù)溶于甲醇中, 配置成系列有機(jī)碳(OC)標(biāo)準(zhǔn)溶液(線性范圍1.0～20.0 mg/L)。測(cè)定溶液254 nm 吸光度(A), 經(jīng)計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線:

式中,COC為甲醇溶液中PPL-DOM 有機(jī)碳濃度,A為DOM 甲醇溶液在254 nm 吸光度。該方法檢出限為0.5 mg C/L。

有色溶解性有機(jī)質(zhì)(cDOM)代表了DOM 中可吸收紫外可見光的組分, 一定程度上cDOM 的紫外吸收系數(shù)可以反映水體cDOM的豐度(郭衛(wèi)東等, 2018)。但不同環(huán)境水體cDOM 的吸光系數(shù)受有機(jī)質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響, 而cDOM 的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要與其來源有關(guān)(李奕潔等, 2015), 如河口區(qū)cDOM 存在更多的陸地維管植物代謝產(chǎn)物貢獻(xiàn), 而在遠(yuǎn)海以浮游植物代謝產(chǎn)物貢獻(xiàn)為主, 這種cDOM 來源差異會(huì)導(dǎo)致不同水體DOM的吸光度與DOC 濃度之間的關(guān)系不一致。因此使用該方法只是用來估算甲醇中DOC 含量(半定量), 建議使用同一海域海水的DOM 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液參比樣品來計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。

1.3.3 元素分析 采用元素分析儀(Unicube,Elementar Analysensysteme GmbH, 德國(guó))測(cè)定, 結(jié)果均已扣除樣品水分與灰分(水分: 馬弗爐75 °C, 兩次測(cè)定,直到恒重; 灰分: 馬弗爐550 °C, 灼燒5 h)。

1.3.4 紅外光譜(FTIR) 采用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS50, Thermo Scientific, 美國(guó))測(cè)定, 光譜采集范圍 4 000～500 cm–1, 取約 1 mg 樣品與100 mg KBr 研磨壓片; Nicolet 軟件包Omnic 8.1 采集和處理。

1.3.5 三維熒光光譜 使用熒光光譜儀(HORIBA Aqualog?, HORIBA Scientific, 日本)進(jìn)行EEM 分析,激發(fā)波長(zhǎng)λEx240～600 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)λEm246～600 nm,掃描間隔3 nm, 掃描速度300 nm/min。樣品溶液中DOM 濃度為5 mg/L, 超純水作空白對(duì)照。

1.3.6 固態(tài)13C NMR 波譜 使用NMR 波譜儀(Avance NEO 600, Bruker, 德國(guó); 150.90 MHz13C NMR)。樣品填裝于3.2 mm 圓柱氧化鋯轉(zhuǎn)子中測(cè)試,獲得全邊帶抑制交叉極化(Cross Polarization/Total Suppression of Sidebands, CP/TOSS)和偶極去相(dipolar dephasing, DD)13C NMR 譜圖(DD 譜圖中可以觀察未被H 取代的碳(non protonated)和易活動(dòng)基團(tuán)(如-OCH3和C-CH3)的信號(hào)), 譜圖使用金剛烷作標(biāo)定。CP/TOSS 譜圖積分: 烷基碳(alkyl), 化學(xué)位移0×10－6～45×10－6, 氮碳/甲氧基(-NCH/-OCH3) 45×10－6～60×10－6, 碳水化合物(-OCH-, HOCH2-) 60×10－6～94×10－6, 碳水化合物端頭碳(-OCHO-) 94×10－6～110×10－6,烯烴碳/芳烴碳(olefins, aryl) 117×10－6～150×10－6, 取代芳香碳(aryl C-O/N-) 150×10－6～164×10－6, 羧基/酰胺(COO, -NC=O) 164×10－6～191×10－6, 酮/醛/蒽醌191×10－6～230×10－6(Maoet al, 2012a)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPL 固相萃取法主要影響參數(shù)

研究了PPL 小柱法放大的PPL 柱實(shí)驗(yàn)參數(shù), 如控制吸附效率最關(guān)鍵的上樣速率、洗脫體積, 并評(píng)估了PPL 樹脂的重復(fù)使用性。

首先進(jìn)行PPL 樹脂的空白測(cè)試。使用過濾后的超純水過清洗干凈的PPL 樹脂柱, 流出液DOC 0.08 mg C/L(RSD 12.0%), 該值接近測(cè)定低限(LOD) 0.040 mg/L,未發(fā)現(xiàn)有污染引入和樹脂流失。使用馬弗爐灼燒除碳的海鹽配置成人工海水(DOC 0.71 mg C/L, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 13.3%, 鹽度為34～35)泵送入清洗干凈的PPL 樹脂柱, 取流出液測(cè)定DOC (n=3), 人工海水流出液DOC 0.85 mg C/L (RSD 11.5%)。

2.1.1上樣流速 不同上樣流速對(duì)PPL 玻璃柱的DOC 吸附效率和DOC 回收率的影響見圖2。DOC 回收率為樹脂吸附前后水樣DOC 的差值與原水樣DOC值之比, 單位時(shí)間內(nèi)的DOC 回收率作為DOC 吸附效率。當(dāng)流速?gòu)?3 BV/h 降低到4 BV/h 時(shí), DOC 吸附效率下降, 從5.52 mg C/h 減少到2.82 mg C/h; 而DOC 回收率升高較快, 從35%升高到56%, 即上樣較慢時(shí), 雖然DOC 吸附效率稍低但回收率較高。流速在6～8 BV/h 時(shí), DOC 吸附效率有較大程度的下降, 回收率均超過50%, 但回收率增長(zhǎng)較緩。經(jīng)綜合考慮, 優(yōu)選8 BV/h 的上樣流速, DOC 吸附效率可達(dá)4.8 mg C/h, 一天(24 h)吸附有機(jī)碳115.2 mg (DOM 約230 mg)。

圖2 上樣流速對(duì)有機(jī)碳回收率及吸附效率的影響Fig.2 Effects of flow rate on DOC recovery and adsorption efficiency

2.1.2洗脫液體積 評(píng)估甲醇的洗脫體積對(duì)DOM回收率的影響。首先使用PPL 樹脂柱(200 g)富集2 400 L 鰲山灣海水(冬季批次), 隨上樣量增加每克PPL 樹脂DOC 回收率如圖3a 所示, 結(jié)果顯示DOC回收率穩(wěn)定在60%左右, 表明PPL樹脂未達(dá)到飽和吸附容量, 水樣中的大部分DOM 均被有效吸附至樹脂上。值得注意的是, 在以往的PPL 小柱研究中, 當(dāng)PPL 樹脂負(fù)載過多即所吸附的DOM 過多時(shí), 會(huì)導(dǎo)致后續(xù)被吸附DOM 的熒光信號(hào)和吸光度發(fā)生明顯變化,并導(dǎo)致回收率降低(Konget al, 2021)。這種樹脂過載導(dǎo)致的 DOM 熒光和化學(xué)分餾的變化會(huì)影響PPL-DOM 后續(xù)的分析, 因此PPL-DOM 樣品比較的前提是保持樹脂上的相對(duì)DOM 負(fù)載量相似, 避免吸附率降低導(dǎo)致的化學(xué)分級(jí)。

采用Dittmar 等(2008)的小柱方法中的甲醇作為洗脫溶劑, 甲醇相較于其他常見可與水混溶的有機(jī)溶劑(如乙醇、正己烷、乙腈等)極性最高, 可以洗脫P(yáng)PL 樹脂上更多的被吸附的DOM 組分, 并且在后續(xù)旋蒸中極易被去除。每洗脫1.67 BV (即1L)甲醇, 取10 mL 的洗脫液, 測(cè)定其UV254值, 并根據(jù)公式(1)計(jì)算得到洗脫液中DOC 濃度(圖3b), 通過對(duì)圖3b 中曲線峰面積進(jìn)行積分, 計(jì)算得用7 BV 可以將樹脂中75%以上的DOC 有效洗脫, 17 BV 的甲醇可以洗脫99%的DOM。圖3b 中可看出4～6 BV 洗脫體積時(shí)洗脫效率明顯降低, 為得到高濃度濃縮液, 本實(shí)驗(yàn)室常選取前4 BV 的甲醇洗脫液進(jìn)行旋蒸凍干, 4 BV 后的甲醇洗脫液則被收集重蒸(除去DOM), 重蒸甲醇可用于下一批次樹脂的初步清洗。

圖3 定制PPL-樹脂柱的DOC 回收率隨上樣海水體積的變化(a); 不同柱體積甲醇洗脫后中PPL-DOM 有機(jī)碳濃度(b)Fig.3 The DOC recovery in customized PPL-resin column with increase in seawater loading volume (a); DOC concentration of PPL-DOM in eluent after eluting with different bed volumes of methanol (b)

除上樣流速、上樣體積以及洗脫溶劑用量等因素,水樣pH 值也影響DOC 回收率。DOM 可以看作是富含多元羧酸的弱電解質(zhì)(Ramoset al, 1999; Hertkornet al, 2006), 水樣充分酸化后有助于質(zhì)子化的DOM分子在樹脂上的有效吸附和提高回收率。水樣酸化(pH=2.0)依照國(guó)際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)(IHSS)地表水DOM 的標(biāo)準(zhǔn)提取方法(Thurmanet al, 1981)以及文獻(xiàn)方法(Laraet al, 1994; Zhanget al, 2018b)和Dittmar 等(2008)的PPL-SPE 小柱方法。

2.1.3 樹脂重復(fù)使用性 選擇SPE 小柱(Bond Elut PPL, 500 mg, 6 mL)測(cè)試PPL 樹脂重復(fù)使用性。連續(xù)提取洗脫10 次北京十三陵水庫(kù)水(每次1 L)并監(jiān)測(cè)每次固相萃取前后水樣的DOC; 結(jié)果表明10 次重復(fù)使用后, PPL-SPE 小柱的回收率依然穩(wěn)定在30%～35%,并沒有隨著樹脂使用次數(shù)增多而下降。使用本文定制PPL 柱(1.2 小節(jié))多批次提取對(duì)近岸海水, 處理海水量在兩年內(nèi)累積達(dá)10 000 L 以上, 而DOC 回收率均穩(wěn)定在50%以上。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明, DOM 吸附率和時(shí)間相關(guān), 屬于動(dòng)態(tài)吸附率。較慢的上樣流速（充分吸附）可以提高DOM 的回收率, 但吸附效率會(huì)下降, 6～8 BV/h 可以滿足常規(guī)要求; 200 g PPL 樹脂柱實(shí)現(xiàn)了2 500L 海水DOM 的高效富集, 回收率可達(dá)60%。以安捷倫提供的PPL 樹脂可吸附樹脂質(zhì)量＞5%的目標(biāo)物計(jì)算, 200 g PPL 樹脂柱可用于5 000 L 以上大體積海水[以總有機(jī)碳(TOC) 1.5 mg/L、DOM 碳含量50%和DOC 回收率60%計(jì)算]有機(jī)碳的富集, 但為避免DOM 分子在樹脂上負(fù)載過大, 尤其飽和吸附影響DOM 的吸附和化學(xué)分級(jí)(Konget al, 2021), 建議處理水量達(dá)到飽和量的50%～80%即可; 長(zhǎng)期使用結(jié)果表明填充的PPL 樹脂柱可以反復(fù)使用(三年測(cè)試均未見同一PPL 柱吸附率明顯下降)。

2.2 DOM 分析表征

將該工藝和裝置應(yīng)用于鰲山灣四個(gè)季節(jié)海水, 處理水量、DOC 含量、DOC 回收率和PPL-DOM 元素分析結(jié)果見表1。上樣流速(11～12 BV/h)過快導(dǎo)致有機(jī)碳回收率偏低(見春季批次), 流速參數(shù)為7.5～8 BV/h 時(shí)DOC 回收率52%～56%, 比文獻(xiàn)報(bào)道稍低, Green 等(2014)用放大的PPL 樹脂柱法(雙柱串聯(lián), 每個(gè)填裝500 g)處理北太平洋和夏威夷海水, DOC 回收率61%。

表1 鰲山灣海水信息和PPL-DOM 元素分析結(jié)果Tab.1 Information of sample at Aoshan Bay and elemental analysis of PPL-DOM samples

2.2.1 元素分析 鰲山灣春夏秋冬PPL-DOM 樣品水分依次為2.59%、4.04%、1.92%、4.70%; 灰分依次為6.21%、6.40%、7.29%、6.82%。PPL-DOM 樣品灰分含量為6.68%±0.47%。

四個(gè)季節(jié)PPL-DOM 元素分析結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定, 扣除水分及灰分后, C、H、N、O 含量分別在46.7%～52.1%、5.98%～6.95%、2.94%～3.31%、35.2%～37.6%。PPL-DOM的元素分析結(jié)果與IHSS 用XAD-8/4 樹脂法提取的淡水溶解性有機(jī)質(zhì)或富里酸(FA)存在一定差異(humicsubstances.org), 淡水NOM 中H 含量更低(一般為4%),N 元素含量也較低(一般為1%～2.5%), O 元素則較高(一般為40%), C 含量與本文所提的PPL-DOM 無(wú)明顯差異; 使用XAD-8/XAD-4 法提取的海洋DOM 元素組成與本文提取的 DOM 結(jié)果相近(Greenet al,2014)。淡水與海水DOM 在H、N、O 元素組成上的差異與兩水體中有機(jī)質(zhì)的來源差異有關(guān), 淡水DOM中存在大量的丹寧、木質(zhì)素(貧氧)以及纖維素(貧氮)等物質(zhì)的降解產(chǎn)物, 海水DOM 中則存在更多藻類代謝所產(chǎn)生的類脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等富氫富氮組分(Emersonet al, 2008)。此外, 鰲山灣PPL-DOM 的C/N 值(摩爾比)為19.4±1.2, 與Dittmar 等(2008)采用PPL-SPE 小柱法提取的海水DOM 的C/N 值(21±1)(揮發(fā)甲醇后,復(fù)溶后測(cè)定)接近, 也表明使用該相同方法提取的樣品與同類方法有很高的可比性。

2.2.2 EEM 分析 對(duì)鰲山灣春冬兩季的海水水樣及PPL-DOM 復(fù)溶溶液(濃度5 mg/L)的EEM 光譜進(jìn)行比較, EEM 譜圖見圖4。海水樣品中除了明顯的類腐殖質(zhì)A 峰和M 峰外(Coble, 1996; 郭衛(wèi)東等, 2018),類蛋白B 峰和T 峰信號(hào)也十分明顯(Nelsonet al,2013), 而PPL-DOM 樣品中熒光組分則主要以類腐殖質(zhì)A 峰信號(hào)為主, B 峰與T 峰兩種類蛋白熒光信號(hào)有明顯降低, 表明PPL 樹脂在對(duì)海水DOM 吸附過程中可能選擇吸附一些有機(jī)氮組分, 某些分子量小極性較強(qiáng)的氨基酸類分子難以回收。

圖4 鰲山灣春冬兩季海水及PPL-DOM 復(fù)溶液的熒光EEM 譜圖Fig.4 The excitation-emission matrix (EEM) fluorescence spectra of original seawaters in spring and winter batches and two seasonal PPL-DOMs from Aoshan Bay

2.2.3FTIR 分析 圖 5 為鰲山灣四個(gè)季節(jié)PPL-DOM 的FTIR 譜圖, 四個(gè)批次PPL-DOM 的有機(jī)官能團(tuán)紅外吸收峰基本特征十分相似, 但也存在差異。在3 430 cm-1附近均存在一個(gè)強(qiáng)吸收峰, 屬于酚類、碳水化合物和羧酸類等組分中的羥基締合羰基后的 O-H 伸縮振動(dòng)的吸收峰(Zhanget al, 2018a);2 960 cm-1處的雙峰可歸屬為長(zhǎng)鏈烷烴類的-CH3和-CH2-, 1 390 cm-1峰也歸屬于-CH3吸收峰; 春、秋、冬季批次在1 729 cm-1附近均存在一個(gè)尖峰(夏季批次光譜在1 719 cm-1發(fā)生紅移), 可歸屬為羧酸或羰基的 C=O 鍵的伸縮振動(dòng)(Abdullaet al, 2010);1 232 cm-1峰為C-O 官能團(tuán)或羧基中OH 基團(tuán)平面變角振動(dòng)形成的弱峰, 在1 080～1 051 cm-1附近峰為碳水化合物中C-O 伸縮振動(dòng)。

圖5 鰲山灣四個(gè)季節(jié)次PPL-DOM 的FTIR 譜圖Fig.5 The FTIR spectra of PPL-DOM extracted from water in different seasons of Aoshan bay

2.2.4固態(tài)13C NMR 分析由于DOM 成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 吸收峰重疊, FTIR 光譜的定性分析也受到一定限制, 而NMR 技術(shù)作為一種對(duì)樣品中有機(jī)碳官能團(tuán)定量的分析技術(shù)(Maoet al, 2012b; Tfailyet al, 2013;Venelet al, 2021), 對(duì)DOM 分析有很大優(yōu)勢(shì), 尤其是固態(tài)13C 核磁共振分析。圖6 展示了鰲山灣冬季、紅樹林濕地潮溝水以及威海桑溝灣PPL-DOM 的固態(tài)13C CP/TOSS NMR 譜圖, 其DD 譜圖顯示了非H-C的碳(non-protonated C)和活動(dòng)(mobile)甲氧基/甲基(-OCH3/-CCH3)碳(圖6), 譜圖積分結(jié)果見表2。

表2 PPL-DOM 固態(tài)13C CP-TOSS NMR 譜圖積分表Tab.2 Integration results of 13C CP/TOSS NMR of PPL-DOM samples

圖6 PPL-DOM 固態(tài)13C CP/TOSS NMR 譜圖Fig.6 Solid-state 13C NMR spectra of different PPL-DOM samples

三個(gè)不同來源的PPL-DOMs 譜圖均顯示較強(qiáng)的烷烴、碳水化合物、芳烴、羧基/酰胺信號(hào), 與典型海水DOM 基本特征相同(Maoet al, 2012a; Zhanget al,2018b)。DOM 中烷基碳信號(hào)(0～45×10－6, 其中30×10－6為長(zhǎng)鏈烷烴的-CH2-)較強(qiáng), 羰基(醛/酮, 191×10－6～230×10－6)在樣品中則含量較少。根據(jù)表3 中DOM 的親水性指數(shù)(Hydrophilicity Index, HI)和芳香碳含量(Aromaticity), 桑溝灣PPL-DOM 顯示更強(qiáng)的親水性(HI 值為1.51), 其芳香族碳含量(12.5%)略高于鰲山灣(9.07%)和紅樹林(10.1%)樣品。濕地和近岸海水PPL-DOM 在有機(jī)碳組成上也存在明顯差異: 紅樹林濕地PPL-DOM 的DD 譜圖在53×10－6處存在一個(gè)明顯的尖峰, 該信號(hào)歸屬于木質(zhì)素中甲氧基的信號(hào), 表明樣品中豐富的木質(zhì)素來源物質(zhì), 這些信號(hào)來源于濕地紅樹林植物降解產(chǎn)物(Zhanget al, 2013); 鰲山灣和桑溝灣PPL-DOM 存在較高的氧烷基信號(hào)(60×10－6～94×10－6), 結(jié)合98×10－6附近的O-C-O (anomeric C)信號(hào), 表明樣品中含較多的碳水化合物, 可能來源于大型藻類(如海帶)代謝產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)(房景輝等, 2021)。

使用該放大的PPL-SPE 法和裝置及優(yōu)化的工藝提取富集純化的多批次PPL-DOM 結(jié)果顯示, DOC 回收率穩(wěn)定, 且樣品的元素組成與文獻(xiàn)結(jié)果相近(Dittmaret al, 2008; Greenet al, 2014), 樣品C 含量也與IHSS河水和湖水富里酸(如1R101F、1R105H)相近, 但相比淡水, 海水DOM 的O 元素含量稍低, 而H、N 元素含量稍高, 反映出海水與淡水水體有機(jī)質(zhì)來源的差異; FTIR 和NMR 結(jié)果表明DOM 結(jié)構(gòu)組成以羧基、羰基、烷烴類(類脂質(zhì))以及碳水化合物等為主。不同水生態(tài)系統(tǒng)PPL-DOM的固態(tài)13C NMR結(jié)果表明不同樣品間碳官能團(tuán)存在明顯差異, 顯示出DOM 陸源和生源前體化合物來源的差異。

比較PPL-DOM 與原海水水樣熒光EEM 譜圖,可以看出PPL 樹脂對(duì)某些含氮組分存在一定的選擇吸附。但目前幾種常用海水DOM 樹脂提取方法中,XAD 大孔樹脂以及C18 固相萃取樹脂等對(duì)海水DOM的回收率明顯低于PPL 樹脂法, 膜法中超濾法也只能實(shí)現(xiàn)高分子量DOM 的富集, 電滲析耦合反滲透(RD/ED)技術(shù)雖然可以實(shí)現(xiàn)較高的DOC 回收率(70%以上)(Chenet al, 2014), 但該方法制備的固體樣品依然灰分很高。綜合對(duì)比, 放大的PPL 樹脂固相萃取法能得到純度較理想的低灰分 DOM 樣品, 同時(shí)PPL-DOM 中有機(jī)成分能代表海水DOM 的主要特征。將來可通過多種樹脂或技術(shù)聯(lián)用的方法提高DOM 的回收率, 如Green 等(2014)報(bào)道了PPL 樹脂與電滲析耦合反滲透技術(shù)聯(lián)用。

3 結(jié)論

本文對(duì)PPL 固相萃取(小柱)法進(jìn)行放大, 建立了大體積海水中DOM 的提取工藝, 搭建提取裝置, 簡(jiǎn)化調(diào)酸步驟, 優(yōu)化上樣和洗脫技術(shù)參數(shù), 并成功應(yīng)用于多批次海水克級(jí)DOM 的富集提取和純化。分析表征結(jié)果表明PPL-DOM 樣品性質(zhì)穩(wěn)定, 不同來源海水DOM 中的前體化合物信息也能得到保留。該技術(shù)提取的大體積海水DOM, 可廣泛用于數(shù)據(jù)比對(duì)、DOM結(jié)構(gòu)分析、微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等工作。PPL-SPE 方法是目前DOM 富集純化最為有效的方法之一, 下一步將開展PPL-SPE 法與其他提取技術(shù)聯(lián)用的工作以提高方法的回收率。

致謝感謝山東大學(xué)結(jié)構(gòu)成分與物性測(cè)量平臺(tái)董姝麗教授和于群博士在論文中樣品的固態(tài)13C NMR數(shù)據(jù)測(cè)定和分析中所提供的幫助; 感謝山東大學(xué)海洋研究院海洋碳匯儀器測(cè)試平臺(tái)老師和同學(xué)的大力協(xié)助。