感染性休克患者PCSK9 水平及其對(duì)預(yù)后評(píng)估價(jià)值的分析

周 吉 陳 碩 溫旭智

1.江蘇大學(xué)附屬宜興人民醫(yī)院急診科，江蘇宜興 214200；2.江蘇大學(xué)附屬宜興人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇宜興 214200

膿毒癥是由微生物感染引起的全身性炎癥，具有極高的預(yù)后不良率和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其中感染性休克是膿毒血癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥。膿毒癥患者可表現(xiàn)出細(xì)胞功能、免疫調(diào)節(jié)、凝血和代謝紊亂的改變，針對(duì)感染性休克的治療，強(qiáng)調(diào)干預(yù)時(shí)間窗短，必須及時(shí)控制感染源，恢復(fù)血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)，因此尋找一種有效的生物標(biāo)志物在膿毒癥研究中發(fā)揮了重要作用。超敏C 反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、降鈣素原(procalcitonin,PCT）是評(píng)估患者感染程度的經(jīng)典指標(biāo)，但在非感染性炎癥情況下可能會(huì)升高，缺乏特異性。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin 9,PCSK9）參與了不同疾病的病理生理學(xué)機(jī)制，例如動(dòng)脈粥樣硬化、病毒和細(xì)菌感染、癌癥、肥胖癥、糖尿病、阿爾茨海默病、高血壓、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性創(chuàng)傷，表明PCSK9 水平升高與細(xì)菌或病毒感染和敗血癥之間存在關(guān)聯(lián)[1]。研究表明，PCSK9 水平較低的患者感染性休克的結(jié)局更好[2]，也有研究證實(shí)，膿毒癥患者的PCSK9 水平升高，可使內(nèi)毒素清除率降低和器官衰竭率增加[3]，但是國(guó)內(nèi)將PCSK9 用于感染性休克患者預(yù)后評(píng)估的研究還較少。因此，本研究分析感染性休克患者的PCSK9、CRP、PCT 水平，并探討三者對(duì)感染性休克患者預(yù)后的預(yù)測(cè)效能，為臨床上感染性休克患者的預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年1 月至2022 年3 月江蘇大學(xué)附屬宜興人民醫(yī)院收治的感染性休克患者135 例，根據(jù)1 周內(nèi)的轉(zhuǎn)歸情況，將病情穩(wěn)定、好轉(zhuǎn)、治愈的患者歸為好轉(zhuǎn)組（n=77），將出院時(shí)意識(shí)昏迷、放棄治療、死亡的患者歸為預(yù)后不良組（n=58）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確的感染灶（血液、尿、腦脊液、傷口、呼吸道分泌物、其他體液等標(biāo)本培養(yǎng)陽性）同時(shí)快速序貫器官衰竭評(píng)分≥2分；②體溫>38℃或<36℃；心率>90 次/分或低血壓（收縮壓<90mmHg，1mmHg=0.133kpa，或較基線降低>40mmHg）；呼吸頻率>20 次/分或通氣障礙（動(dòng)脈血 CO2分壓<32mmHg）；外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12.0×109/L 或<4.0×109/L，或未成熟白細(xì)胞比例>10%。③使用足夠液體補(bǔ)液及需要血管活性藥物維持平均動(dòng)脈壓≥65mmHg，血乳酸>2mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多發(fā)傷伴有活動(dòng)性臟器出血；②有嚴(yán)重的自身免疫性疾??；③惡性腫瘤的終末期患者及使用多種靶向藥物的腫瘤患者；④有慢性感染性疾病，如活動(dòng)性結(jié)核、人類免疫缺陷病毒感染等。其中男68 例，女67 例，年齡23～94 歲，平均（71.20±12.40）歲，健康對(duì)照組選擇在江蘇大學(xué)附屬宜興人民醫(yī)院體檢中心進(jìn)行定期體檢的健康人135 例，男70 例，女65 例；年齡35～75 歲，平均（55.20±15.15）歲。一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得江蘇大學(xué)附屬宜興人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2019-18），患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

離心機(jī)購(gòu)自北京白洋醫(yī)療器械有限公司（型號(hào)：BY-320C），干式熒光免疫分析儀購(gòu)自萬孚生物公司（型號(hào)：FS-301），全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自Mindray邁瑞醫(yī)療公司（型號(hào)：BC-7500），PCSK9 人酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自Abcam 公司（型號(hào)：ab209884），hs-CRP 乳膠增強(qiáng)免疫散射比濁法試劑購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司，PCT 熒光免疫分析試劑購(gòu)自廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司。

使用無抗凝劑的采血管，感染性休克患者在治療前及治療后1d、3d、5d 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，健康體檢組在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取5ml 靜脈血，4000 轉(zhuǎn)/min離心15min，取血清3ml 儲(chǔ)存于EP 管中，在-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法檢測(cè)PCSK9，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，簡(jiǎn)易操作如下：24℃解凍患者血液標(biāo)本；配制洗滌液制備各濃度梯度的PCSK9 標(biāo)準(zhǔn)品；稀釋患者血液樣本加樣于96 孔板每孔100μl，并且加100μl 標(biāo)準(zhǔn)品，25℃恒溫孵育60mmin，結(jié)束后洗滌4 次；加入二抗25℃恒溫孵育60min，結(jié)束后洗滌4 次；加入顯色劑后避光，溫恒25℃孵育20min；終止反應(yīng)后在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。采用熒光免疫檢測(cè)PCT，按儀器與試劑盒操作說明在干式熒光免疫分析儀上測(cè)定。通過全自動(dòng)生化分析儀，使用乳膠增強(qiáng)免疫散射比濁法檢測(cè)hs-CRP 水平。記錄患者在重癥監(jiān)護(hù)病房的住院結(jié)局及住院天數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析PCSK9、hs-CRP、PCT的水平，預(yù)測(cè)感染性休克患者預(yù)后的效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 感染性休克患者與健康體檢組的PCSK9、PCT、hs-CRP 水平比較

治療前，感染性休克組的3 個(gè)指標(biāo)水平均高于健康體檢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 感染性休克組與健康體檢組PCSK9、PCT、hs-CRP 水平比較（ ）

表1 感染性休克組與健康體檢組PCSK9、PCT、hs-CRP 水平比較（ ）

2.2 預(yù)后不良組和好轉(zhuǎn)組治療各時(shí)間點(diǎn)PCSK9、PCT、hs-CRP 水平比較

治療前，預(yù)后不良組和好轉(zhuǎn)組的PCSK9、PCT、hs-CRP 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療后1d、3d、5d，預(yù)后不良組的PCSK9 水平均明顯高于好轉(zhuǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；治療后1d、3d，預(yù)后不良組的PCT 水平與好轉(zhuǎn)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療后5d，預(yù)后不良組PCT 水平高于好轉(zhuǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；治療后1d，預(yù)后不良組hs-CRP 水平與好轉(zhuǎn)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療后3d、5d，預(yù)后不良組的hs-CRP 水平明顯高于好轉(zhuǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 預(yù)后不良組和好轉(zhuǎn)組治療各時(shí)間點(diǎn)PCSK9、PCT、hs-CRP 水平比較（ ）

表2 預(yù)后不良組和好轉(zhuǎn)組治療各時(shí)間點(diǎn)PCSK9、PCT、hs-CRP 水平比較（ ）

2.3 PCSK9、PCT、hs-CRP 在預(yù)測(cè)感染性休克患者預(yù)后的ROC 曲線分析

分析治療后5d 的PCSK9、PCT、hs-CRP 水平，計(jì)算3 者的預(yù)測(cè)患者ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC），其中PCSK9 的AUC 最大，PCSK9 與hs-CRP 的AUC 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.092，P<0.05）。PCSK9 與 PCT的 AUC 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.291，P<0.05）。PCT 與hs-CRP 的AUC 比較，差異為0.0662，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.014，P>0.05)，見圖1、表3。

表3 治療后5d PCSK9、PCT、hs-CRP 水平預(yù)測(cè)感染性休克患者預(yù)后效能

圖1 PCSK9、PCT、hs-CRP 水平預(yù)測(cè)感染性休克患者預(yù)后的ROC 曲線分析

3 討論

近年來，感染性休克已然成為重癥醫(yī)學(xué)科及急診科醫(yī)生面臨的最常見和最嚴(yán)重的問題，是重癥監(jiān)護(hù)病房中最常見的死亡原因之一，隨著社會(huì)老齡化加劇，該疾病的發(fā)病率持續(xù)上升[4]。感染性休克患者的死亡率為20%～80%[5]，感染性損傷可導(dǎo)致患者發(fā)生全身性炎癥，進(jìn)而影響機(jī)體多個(gè)器官和系統(tǒng)，發(fā)生一系列的生理紊亂，目前的治療主要為感染源頭控制、抗生素支持性干預(yù)、患者內(nèi)環(huán)境紊亂的糾正[6]，特別是早期目標(biāo)導(dǎo)向治療，發(fā)現(xiàn)某些特定炎癥因子作為潛在診斷和判斷其預(yù)后的生物標(biāo)志物，在感染性休克患者的臨床治療方案選擇上至關(guān)重要。

PCSK9 是前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族中第9 個(gè)成員，人類PCSK9 基因定位于1p32.3，由12 個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)22kb，編碼692 個(gè)氨基酸[7]，是由分子量為74 kDa 的可溶性pro-pcsk9 經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自催化生成，同時(shí)還參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡和肝再生，又稱為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶-1（neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC1）[8]，PCSK9 蛋白由信號(hào)肽（包括30 個(gè)氨基酸）、前結(jié)構(gòu)域（122 個(gè)氨基酸）、催化結(jié)構(gòu)域（299 個(gè)氨基酸）和富含半胱氨酸、組氨酸的C-端結(jié)構(gòu)域（279 個(gè)氨基酸）組成[9]，可在肝臟、小腸、腎臟、胰腺表達(dá)，肝臟是PCSK9 蛋白發(fā)揮作用的主要靶器官[10]，也是循環(huán)PCSK9 的主要來源。

感染性休克通常是嚴(yán)重微生物感染的致命并發(fā)癥，可引發(fā)不受控的全身性炎癥和器官衰竭，而這些致病微生物細(xì)胞壁的致病性脂質(zhì)部分，如革蘭氏陰性菌的脂多糖、脂磷壁酸、磷脂甘露聚糖[11]，這些病原體脂質(zhì)成分是哺乳動(dòng)物先天免疫受體Toll樣受體的主要配體，它們?cè)谀摱拘匝装Y（膿毒性休克或膿毒癥）中發(fā)揮重要作用。病原體脂質(zhì)最初會(huì)結(jié)合到高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）中，隨后會(huì)轉(zhuǎn)移到低密度脂蛋白（low-density lipoprotein,LDL）或極低密度脂蛋白（very lowdensity lipoprotein，VLDL）中，由肝臟從血液中清除，在肝臟中解毒，最終在膽汁中分泌[12]；最近研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9 會(huì)導(dǎo)致脂蛋白受體進(jìn)行降解，包括低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor,LDLR），極低密度脂蛋白受體（very low-density lipoprotein receptor，VLDLR）和LDLR 相關(guān)蛋白1，從而減少肝臟對(duì)循環(huán)內(nèi)病原脂蛋白的攝取，病原體脂質(zhì)的肝臟清除率下降，所以PCSK9 被認(rèn)為對(duì)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要[13]。在Dwivedi 等[14]的膿毒癥小鼠模型試驗(yàn)中，通過對(duì)PCSK9 基因敲除的小鼠進(jìn)行肺組織病理學(xué)分析以及肺組織的髓過氧化物酶測(cè)定，都表明PCSK9 缺乏可以減少全身細(xì)菌傳播，使到達(dá)肺部的細(xì)菌數(shù)量下降，中性粒細(xì)胞募集減少，全身炎癥反應(yīng)明顯減輕；Walley 等[15]的一個(gè)多中心臨床觀察性隊(duì)列研究也發(fā)現(xiàn)，有PCSK9 基因的功能喪失感染性休克患者在28d 內(nèi)的存活率可增加71.7%；Genga 等[16]的一項(xiàng)回顧性觀察研究表明，具有多個(gè)功能缺失PCSK9 等位基因的患者1 年死亡或感染相關(guān)再入院的風(fēng)險(xiǎn)較低，PCSK9 缺乏可防止全身細(xì)菌傳播、器官病理和組織炎癥[17]，特別是在肺和肝臟中，而PCSK9 過表達(dá)會(huì)加劇多器官病理以及早期膿毒癥的高凝狀態(tài)和促炎狀態(tài)[18]，因此PCSK9 可作為一項(xiàng)感染性休克患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，已出現(xiàn)感染性休克的患者在治療前外周血的PCSK9、PCT、hs-CRP 較健康人群明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；比較感染性休克患者預(yù)后不良組和好轉(zhuǎn)組治療前、治療后1d、3d 的PCT 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療5d 后兩組的PCT 比較，好轉(zhuǎn)組PCT 較預(yù)后不良組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)比預(yù)后不良組和好轉(zhuǎn)組的治療前、治療后1d 的hs-CRP，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在治療后3d、5d，比較兩組的hs-CRP，好轉(zhuǎn)組的hs-CRP 水平較預(yù)后不良組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過患者外周血PCSK9 的數(shù)據(jù)分析得出，治療前，預(yù)后不良組和好轉(zhuǎn)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后1d，對(duì)比兩組PCSK9 水平發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后3d、5d 與預(yù)后不良組比較，好轉(zhuǎn)組的PCSK9 水平明顯出現(xiàn)下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究數(shù)據(jù)說明，監(jiān)測(cè)PCSK9 有助于評(píng)估感染性休克患者病情，通過ROC 曲線分析可以看出，PCSK9 對(duì)比PCT、hs-CRP 的AUC 更大，截?cái)嘀?、敏感度、特異性均?yōu)于PCT 和hs-CRP，說明PCSK9對(duì)感染性休克患者的預(yù)測(cè)效能更高，是一種有效的生物標(biāo)志物。

綜上所述，感染性休克患者外周血PCSK9 水平明顯上調(diào)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PCSK9 水平有助于評(píng)估患者治療后的預(yù)后情況，且其預(yù)測(cè)效能優(yōu)于PCT、hs-CRP。但本研究也存在一定的局限性，入組的患者人數(shù)相對(duì)較少，患者疾病分類不夠細(xì)化，研究結(jié)果可能存在一定的偏倚。同時(shí)，PCSK9 是一個(gè)感染性休克的潛在治療靶點(diǎn)，未來可開展更大樣本的前瞻性研究，同時(shí)將進(jìn)一步展開PCSK9 抑制劑在感染性休克動(dòng)物模型中研究。