三疣梭子蟹aqp2基因克隆及其在蛻皮中的功能

吳 捷 呂建建 張偉偉 李玉坤 高保全 劉 萍

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室, 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 青島 266235)

水通道蛋白(Aquaporin, AQP)最早由Agre以及其同事發(fā)現(xiàn)并命名[1,2], 該蛋白是可以運輸水和其他小分子物質(zhì)的通道蛋白, 普遍存在于動、植物及微生物中。之前的研究證實AQP所介導(dǎo)的自由水快速被動地跨生物膜轉(zhuǎn)運是水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑[3,4]。目前發(fā)現(xiàn)了多種具有不同功能的AQP基因,其中有的只與水的運輸相關(guān), 被稱為“Classical aquaporins”(C-AQP), 有的除了能夠運輸水分子外還能介導(dǎo)大分子的甘油等物質(zhì)運輸, 稱為“Aquaglyceroporins”(AQGP)[5]; 隨后在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分化、凋亡等細(xì)胞活動中發(fā)揮作用的水通道蛋白, 稱之為“Super auqaporins”或“Subcellular aquqporins”(S-AQP)[6];另外, AQP-8與氨的運輸有關(guān)[7], 被單獨列為一個亞家族[8]。

在水產(chǎn)動物中, AQP基因的研究主要集中于滲透壓調(diào)節(jié)或鹽度適應(yīng)功能。比如在莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)、刀鱭(Coilia nasus)和卵形鯧(Trachinotus ovatus)等魚類中均發(fā)現(xiàn)AQP基因發(fā)揮重要的滲透壓調(diào)節(jié)功能[9—11]。此外,還發(fā)現(xiàn)該基因在魚類低溫適應(yīng)中也具一定的作用[12,13]。在水生甲殼動物中, AQP基因的克隆及功能研究也有零星報道。王渝等[14]在三疣梭子蟹克隆并證明了AQP基因在鹽度適應(yīng)中發(fā)揮作用。楊志剛等[15]克隆了中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)AQP并發(fā)現(xiàn)其在具有滲透壓調(diào)節(jié)作用。然而, 該基因在甲殼動物中是否還具有其他功能, 相關(guān)研究報道較少。

水生甲殼動物的蛻皮伴隨著大量水分進(jìn)入體內(nèi)。之前的研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)在蛻皮過程中大量水通過腸和胃進(jìn)入生物體內(nèi)[12], 并初步證明了AQP參與了甲殼動物蛻皮過程中的細(xì)胞體積調(diào)節(jié)[16—18]。蛻皮激素(MH)是調(diào)控蛻皮的關(guān)鍵激素[19], 然而, AQP基因在水生甲殼動物蛻皮吸水過程中是否受該激素調(diào)控尚未見報道。

三疣梭子蟹是我國重要的海水養(yǎng)殖品種[20]。本研究通過RACE技術(shù)克隆ptaqp2基因全長, 明確該基因的序列特征及組織表達(dá)分布模式。采用熒光定量PCR(qPCR)技術(shù), 分析其在不同蛻皮時期以及MH刺激后的表達(dá)規(guī)律。利用RNAi技術(shù)敲降ptaqp2基因的表達(dá), 以研究其對蛻皮的影響。研究結(jié)果有助于深入解析水生甲殼動物的蛻皮機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物 三疣梭子蟹取自山東濰坊昌邑海豐水產(chǎn)有限公司, 蟹處于同一發(fā)育時期, 體重為(35.5±5.5) g。飼養(yǎng)在5個室內(nèi)養(yǎng)殖用的蟹池(蟹池長為4 m, 寬為2.5 m, 高為1.3 m), 池中注入20 m3, 鹽度為33, pH為8.3的自然海水, 每池100只, 暫養(yǎng)3d。水溫控制在(25±1)℃, 持續(xù)供氧, 每天下午定時換1/3體積的海水, 換水后定時投喂新鮮的藍(lán)蛤(Potamocorbula laevis)。

不同蛻皮周期材料制備根據(jù)甲殼硬度和游泳足趾節(jié)末端新舊表皮的變化[21], 將暫養(yǎng)蟹分為蛻皮后期(A)、蛻皮間期(C)和蛻皮前期(D), 并各取3只, 分別解剖, 取腸、胃、肌肉和眼柄四個組織于液氮中保存。

MH刺激后材料制備從暫養(yǎng)的蟹中, 挑選50只健康的三疣梭子蟹, 依據(jù)擬穴青蟹和三疣梭子蟹蛻皮時期的MH含量[22,23], 向三疣梭子蟹注射MH(注射部位游泳足基部, MH濃度為40 ng/mL),注射MH激素后于0、24h、48h和72h隨機(jī)挑選3只蟹解剖, 取腸、胃、肌肉和眼柄4個組織, 樣品液氮保存。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取各個實驗組的總RNA, 利用核酸定量儀(NanoDrop 2000 Thermo Scientific)檢測RNA的濃度及質(zhì)量, 通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA模板, 用于ptaqp2基因定量分析。

1.3 基因克隆

隨機(jī)選取9只暫養(yǎng)3d的三疣梭子蟹, 取心臟、表皮、胃、肝胰腺、血細(xì)胞(抽取的血淋巴加等量抗凝劑存于1.5 mL離心管, 4℃, 7000 r/min離心10min, 棄上清)、眼柄、肌肉、腸和鰓9個組織液氮儲存?zhèn)? 提取RNA并合成3′和5′RACE的cDNA模板, 通過實驗室已有的該基因序列設(shè)計3′和5′RACE引物[24], 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。反應(yīng)體系參照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase說明書, 反應(yīng)程序95℃3min; 95℃ 15s, 65℃ 15s, 72℃ 1min, 共35個循環(huán);72℃ 10min, 進(jìn)行3′和 5′擴(kuò)增。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收, 連接轉(zhuǎn)化, 挑取陽性單克隆, 通過DNA測序通用引物M13進(jìn)行菌落PCR鑒定, 將目的產(chǎn)物送睿博生物公司進(jìn)行測序。使用SeqMan軟件去掉測序結(jié)果中的冗余序列后, 然后利用Cexpress軟件拼接獲得完整的基因序列。

表1 實驗所用的引物序列Tab. 1 The sequence of primers used in the experiment

1.4 序列分析

利用軟件BioEdit預(yù)測ORF開放閱讀框, 并翻譯為蛋白序列; 將蛋白序列提交到SignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 預(yù)測信號肽; 通過NCBI的保守結(jié)構(gòu)域(CDD)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/search)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和確定; 采用TMHMM SerVer .2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用DNAMAN 分析軟件將三疣梭子蟹的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行多重序列比對; 最后通過軟件 MEGA 7.0以Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[25]。

1.5 qPCR分析

根據(jù)已知的三疣梭子蟹管家基因β-actin和以獲得全長的ptaqp2基因, 通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計內(nèi)參引物和熒光定量特異性引物(表1)。采用實時熒光定量PCR(qPCR)對ptaqp2基因在各個組織以及各個實驗組中的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測分析,反應(yīng)體系為: 2×SYBR?Green ProTaqHS Premix Ⅱ 5 μL, ROX 0.2 μL, Primer F 0.4 μL, Primer R 0.4 μL,Template cDNA 1 μL, ddH2O 3 μL; 程序參照TOYOBO SYBR?Green Real-time PCR Master Mix說明書進(jìn)行。結(jié)果采用 2–ΔΔCt方法計算,借助SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 后續(xù)使用Origin Pro和Excel軟件進(jìn)行結(jié)果的統(tǒng)計與整理,P<0.05為差異顯著[26]。

1.6 RNAi實驗

RNAi實驗所用的雙鏈RNA由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計及合成,ptaqp2ai:GGUCUGGAGUUUCUCUUAATT;ptaqp2bi:CCCAGUCAGUGUAUGCCAATT;ptaqp2ci:CCAGUAAGUCAGGUGUAUUTT; NC: UUCUCC GAACGUGUCACGUTT。將雙鏈RNA濃度稀釋為1 μg/μL, 并將3個雙鏈RNA按等體積混合。隨后選取處于蛻皮前期的三疣梭子蟹, 利用微量注射器按體重向游泳足基部注射(注射量為1 μg/g)。實驗設(shè)計空白對照組、NC(陰性對照)對照組以及干擾實驗組(實驗持續(xù)10d, 確?？瞻讓φ战M蛻皮率達(dá)70%以上), 每組共3個平行, 分別于0、24h和48h取腸、胃、肌肉和肝胰腺于液氮保存, 并提取RNA[26]。

2 結(jié)果

2.1 ptaqp2基因的cDNA序列全長克隆及序列分析

ptaqp2基因cDNA序列全長4126 bp, 3′端和5′端非編碼區(qū)分別為425和2132 bp, 開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)為1569 bp, 共編碼氨基酸522個, 分子質(zhì)量56.17 kD, 理論等電點為8.84。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示該基因具有MIP保守結(jié)構(gòu)域pfam00230。Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示此基因有MIP功能結(jié)構(gòu)域PF00230.20?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,該基因具有6個跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 ptaqp2同源性分析

將ptaqp2的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行氨基酸序列比對:ptaqp2基因與人(Homines)AQP2、AQP4基因、小鼠(Mus musculus)AQP2、AQP4基因、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的 bib基因、埃及伊文(Aedes aegypti)的AQPe.a基因和大青葉蟬(Cicadella viridis)的AQP-cic基因同源性分別為43.36%、40.60%、42.92%、40.17%、43.32%、39.69%和38.40%。所有比對的基因都含有AQP所具有的兩個保守的NPA序列。聚類分析表明(圖1和圖 2),ptaqp2與黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的 bib基因聚為一枝, 同屬于水通道蛋白四大類中的C-AQP。

圖1 三疣梭子蟹水通道蛋白ptaqp2的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic analysis of aquaporin ptaqp2 from P. trituberculatus

2.3 ptaqp2的組織表達(dá)特點

利用qPCR技術(shù), 對ptaqp2基因進(jìn)行全組織表達(dá)的分析(圖3):ptaqp2呈泛組織表達(dá), 在眼柄、腸、肌肉、心臟、表皮、胃、肝胰腺、血細(xì)胞及鰓中均有表達(dá), 其中在眼柄中表達(dá)最高, 其次為腸和肌肉, 在血細(xì)胞和鰓中幾乎不表達(dá)。

圖3 三疣梭子蟹ptaqp2基因在不同組織中的表達(dá)分析Fig. 3 Relative mRNA expression level of P. trituberculatus ptaqp2 gene in different tissuesH. 心臟; C. 表皮; S. 胃; Hp. 肝胰腺; B. 血細(xì)胞; E. 眼柄; M. 肌肉; I. 腸; G. 鰓H. Heart; C. Cuticle; S. Stomach; Hp. Hepatopancreas; B. Blood;E. Eyestalk; M. Muscle; I. Intestine; G. Gill

2.4 ptaqp2在不同蛻皮時期的表達(dá)規(guī)律

ptaqp2在4個組織(肌肉、腸、胃和眼柄)中都在蛻皮前期高表達(dá)。與蛻皮后期相比表達(dá)上調(diào)1.5倍左右, 差異顯著(P<0.05)。在蛻皮間期表達(dá)較低, 與蛻皮后期相比表達(dá)下調(diào), 在腸、胃組織中與蛻皮后期相比分別下調(diào)了1倍和2倍, 差異顯著(P<0.05), 但在肌肉與眼柄中差異不顯著(圖4)。

圖4 三疣梭子蟹ptaqp2基因在不同蛻皮時期組織中的表達(dá)分析Fig. 4 Relative mRNA expression level of ptaqp2 in P. trituberculata at different moulting periodsA. 蛻皮后期; C. 蛻皮間期; D. 蛻皮前期; M. 肌肉; I. 腸; S. 胃;E. 眼柄; 不同字母表示組間差異顯著(P<0.05), 相同字母表示組間差異不顯著; n=3, ±SD; 下同A. Post-molt stages; C. Intermolt stage; D. Proecdysis stage;M. Muscle; I. Intestines; S. Stomach; E. Eyestalk; Different letters indicate significant differences (P<0.05). Same letters indicate no significant differences. The same applies below

2.5 ptaqp2在MH刺激下的表達(dá)模式

在MH刺激后(圖5),ptaqp2在眼柄中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢, 持續(xù)到72h, 與0相比下調(diào)2倍左右, 差異顯著(P<0.05); 除眼柄外的3個組織(肌肉、腸和胃)中都呈現(xiàn)出不同的上調(diào)表達(dá)趨勢, 但表達(dá)趨勢有所不同。在肌肉和胃中持續(xù)上調(diào)到72h, 表達(dá)量最高時約為0的2倍, 差異顯著(P<0.05); 在腸中24h表達(dá)量達(dá)到最高約為0的2.5倍差異顯著(P<0.05), 隨后下調(diào), 72h時恢復(fù)正常表達(dá)水平。

圖5 MH刺激下三疣梭子蟹ptaqp2在不同組織中的表特點Fig. 5 Relative mRNA expression level of ptaqp2 in in different tissues of P. trituberculata stimulated by MHM. 肌肉; I. 腸; S. 胃; E. 眼柄M. Muscle; I. Intestines; S. Stomach; E. Eyestalk

2.6 ptaqp2敲降對蛻皮率的影響

注射雙鏈RNA后(圖6), 在3個組織(胃、腸和肌肉)中ptaqp2基因的表達(dá)均顯著下調(diào)。其中在胃和肌肉組織中24h時干擾效果最顯著, 干擾效率分別為58.14%和51.50%, 在腸組織中48h時干擾效果最顯著, 干擾效率為55.40%, 但在眼柄中未發(fā)現(xiàn)干擾效果。在維持10d的干擾實驗結(jié)束后, 對照組、NC組和干擾組的蛻皮率分別為76.5%、84.6%和33.3%(圖7)。干擾組蛻皮率顯著降低(P<0.05)。

圖6 三疣梭子蟹ptaqp2基因干擾后的表達(dá)分析Fig. 6 Relative mRNA expression level of ptaqp2 after interference in P. tritomatisNC. 陰性對照; IG. 干擾組; S. 胃; M. 肌肉; I. 腸; E. 眼柄NC. Negative control; IG. Interference group; S. Stomach; M.Muscle; I. Intestines; E. Eyestalk

圖7 蛻皮率統(tǒng)計Fig. 7 Moulting rate of different experimental groupsA. 對照組; B. 陰性對照組; C. 干擾組A. Control group; B. Negative control group; C. Interference group

3 討論

AQP廣泛存在于植物、單細(xì)胞生物、無脊椎動物和脊椎動物中, 能夠高效轉(zhuǎn)運水, 在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)AQP在甲殼動物不同蛻皮時期差異表達(dá), 且與Na+/K+-ATPase和Na+/K+/2Cl–等滲透壓調(diào)控相關(guān)基因具有共表達(dá)趨勢[16], 相關(guān)研究表明AQP與甲殼動物的蛻皮密切相關(guān)[17—19]。為進(jìn)一步探究AQP在蛻皮中的功能, 本研究首次克隆了ptaqp2基因, 該基因與果蠅的bib基因聚為一枝, 與PtAQP1基因[14]的同源性在20%左右,但二者均具有兩個保守的NPA結(jié)構(gòu)域, 同屬于水通道蛋白的C-AQP大類的基因。

水生甲殼動物在蛻皮時大量飲水, 之后主要通過腸腺和胃進(jìn)入生物體內(nèi)[16], 其主要表現(xiàn)在肌肉吸水膨脹。相關(guān)研究表明AQP與甲殼動物的蛻皮有關(guān)且參與了的肌肉細(xì)胞體積調(diào)節(jié)[12—14]。在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)ptapq2在眼柄、肌肉、腸和胃中有較高水平的表達(dá), 而上述組織均與甲殼動物的蛻皮密切相關(guān)。另外, 該基因在上述組織不同蛻皮時期顯著差異表達(dá), 其中在蛻皮前期表達(dá)量最高, 相關(guān)文獻(xiàn)表明蛻皮激素(MH)相關(guān)的調(diào)節(jié)基因在蛻皮前期上調(diào)表達(dá), 蛻皮前期是、蛻皮過程重要的準(zhǔn)備階段[19],而ptaqp2基因受MH調(diào)節(jié), 推測其在蛻皮前期高表達(dá), 主要發(fā)揮準(zhǔn)備作用。這表明ptaqp2基因在三疣梭子蟹蛻皮中發(fā)揮一定功能。

蛻皮激素(MH)是蛻皮調(diào)控的重要激素, MH從蛻皮間期開始分泌產(chǎn)生, 在蛻皮前期達(dá)到最大, 蛻皮后期消失[20]。為了驗證AQP基因是否受MH的調(diào)控, 我們進(jìn)行了MH刺激實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 在MH刺激下,ptaqp2基因在腸、胃和肌肉中的表達(dá)均顯著上調(diào)。尤其是在肌肉中, 處理后24h開始上調(diào)表達(dá)并一直持續(xù)到72h。該結(jié)果與不同蛻皮時期的表達(dá)結(jié)果一致, 表明MH能夠刺激ptaqp2基因上調(diào)表達(dá),在三疣梭子蟹蛻皮過程中的吸水環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。值得注意的是, 我們觀察到MH刺激后ptaqp2基因在眼柄中的表達(dá)呈下調(diào)表達(dá)。甲殼動物的蛻皮過程主要是由Y器(Y-organ)分泌的蛻皮類固醇激素MH與X器-竇腺復(fù)合體(X-organ-sinus gland, XOSG)分泌的蛻皮抑制激素MIH相互拮抗而進(jìn)行調(diào)控的, 其中XO-SG甲器官位于眼柄中。我們推測在注射MH后, 導(dǎo)致體內(nèi)MH水平驟升, 可能誘導(dǎo)X器官有限的分泌MIH激素, 而AQP基因的表達(dá)可能會在這一過程中受到抑制。

為了進(jìn)一步證實ptaqp2基因在蛻皮中的功能,我們采用RNAi技術(shù)敲降了該基因在蛻皮前期的表達(dá)量。定量結(jié)果顯示, 該基因在肌肉、胃和腸組織中均被顯著敲降。我們發(fā)現(xiàn)ptaqp2基因敲降組的蛻皮率顯著低于對照組和NC組(P<0.05), 進(jìn)一步明確了ptaqp2基因在三疣梭子蟹蛻皮中發(fā)揮重要作用。

綜上所述, 本研究成功克隆了三疣梭子蟹ptaqp2基因cDNA全長序列并分析了該基因的功能結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域, 豐富了甲殼動物水通道蛋白基因家族。通過分析ptaqp2基因的組織表達(dá)特征、不同蛻皮時期的表達(dá)規(guī)律、MH刺激后的表達(dá)模式及RNAi后的蛻皮情況, 探究了該基因在三疣梭子蟹蛻皮中的功能及可能的調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果有助于系統(tǒng)解析水生甲殼動物的蛻皮機(jī)制。