烯醇化酶1多肽共價修飾改變細(xì)胞的生長和代謝模式

宋學(xué)文 李文玲 朱麗雯 PRITHIVIRAJ Nagarajan 王 軍 嚴(yán)繼舟1,

(1. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)系統(tǒng)和神經(jīng)科學(xué)研究所, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306)

烯醇化酶1(Enolase1, ENO1)存在于許多組織中, 是糖酵解的限速酶, 除在葡萄糖代謝過程中催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸外, 根據(jù)其細(xì)胞定位還參與多種生理和病理過程[1]。在糖酵解代謝, Warburg效應(yīng)是腫瘤異常代謝的主要特征之一, 腫瘤細(xì)胞借助這一異常能量代謝可以逃避正常的細(xì)胞凋亡, 來進(jìn)行增殖和遷移[2]。Warburg效應(yīng)中葡萄糖代謝以糖酵解方式為主, 并抑制線粒體的氧化磷酸化[3]。比如ENO1在卵巢癌和胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[4,5]; ENO1在肝癌組織中高表達(dá)并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[6,7]。但也有研究表明ENO1在非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC)組織中表達(dá)的上調(diào)與臨床結(jié)果相關(guān)性不大[8,9]。Chang等[10]的研究表明, 非小細(xì)胞肺癌中ENO1蛋白水平明顯降低, ENO1過表達(dá)抑制了A549細(xì)胞系向上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)變(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)。這些結(jié)果表明ENO1是一個多功能蛋白。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM)是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的一種重要方式, 對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能起著至關(guān)重要的作用[11]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾幾乎參與細(xì)胞的所有生命活動過程, 發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。常見的修飾方式包括甲基化、磷酸化、泛素化、乙?；⑻腔?、SUMO 化、亞硝基化和氧化等。絕大部分的蛋白質(zhì)在合成過程中或合成后都要經(jīng)過某些形式的翻譯后修飾, 某些疾病常常與一些蛋白質(zhì)異常的修飾有關(guān)。修飾基團(tuán)的加入, 可能會引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變, 從而引起蛋白質(zhì)功能的改變, 進(jìn)而引發(fā)某些疾病。特定的翻譯后修飾還被作為疾病的生物標(biāo)志或治療的靶標(biāo)[12]。

生物活性肽是一類能夠調(diào)節(jié)生物體生理功能的多肽, 參與神經(jīng)調(diào)節(jié)、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、新陳代謝、營養(yǎng)保健、抗氧化和延緩衰老等[13,14]。從肽轉(zhuǎn)運可能性到雙甘肽跨膜轉(zhuǎn)運現(xiàn)象再到寡肽吸收機(jī)制實驗證實蛋白質(zhì)能以肽的形式被人體利用和吸收。相比于蛋白質(zhì)等大分子, 多肽更容易被機(jī)體吸收, 因此被廣泛應(yīng)用于生物活性多肽功能和營養(yǎng)學(xué)的研究。本實驗室前期在研究海星活性成分過程中, 利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測多肽種類, 通過蛋白質(zhì)譜結(jié)果和文獻(xiàn)篩選追蹤到ENO1多肽。我們推測ENO1的不同功能是由ENO1活性多肽的不同化學(xué)修飾引起的。本文通過合成甲基化、乙酰化、磷酸化修飾及不經(jīng)過修飾的ENO1多肽片段, 探究ENO1蛋白的生化功能和對細(xì)胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要實驗材料

細(xì)胞系: PAC2斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞[15,16], 從美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)引進(jìn)。甲基化、乙?；?、磷酸化修飾和未修飾的ENO1多肽(ENO1多肽序列: EG-Me: ELRDNDK(Me)TPYLGKG; EG-Ac:ELRDNDK(Ac)TPYLGKG; EG-Ps: ELRDNDK(Ps)TPYLGKG; EG: ELRDNDKTRYLGKG)由強(qiáng)耀生物公司合成。Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基、胎牛血清、含酚紅的2.5%胰酶為美國Gibco公司產(chǎn)品,CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(Cat.No.C0037)、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Cat.No.C0016)為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品, 線粒體染色試劑盒(Cat.No.E607509)、溶酶體染色試劑盒(Cat.No.E607506)為上海生工生物有限公司產(chǎn)品。2-Phosphoglycerate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(Cat.No.MAK198)為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。RT2ProfilerTMPCR Array試劑盒(Cat. No. PAZF-006Z ), RT2 SYBR?Green qPCR Mastermix(Cat. No. 330529) 和RNeasy Mini Kit(Cat.No.74104)為Qiagen Germany公司產(chǎn)品, PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(Cat. No. RR037B)為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 四種多肽對細(xì)胞的處理

取對數(shù)生長期的PAC2斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞,用含10%胎牛血清的L15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105ind./mL, 向96孔板或LAB-TEK板每個孔中加入100 μL細(xì)胞懸液, 置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Dai等[17]的研究結(jié)果表明海星的甲醇水層提取物在100 μg/mL的濃度下處理細(xì)胞24h作用效果較好。因此, 待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右, 用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液(Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基)分別將4種多肽稀釋至100 μg/mL, 培養(yǎng)PAC2細(xì)胞24h。以不含多肽的稀釋液培養(yǎng)細(xì)胞為空白對照, 所有實驗有3個平行。

1.3 CCK-8法檢測PAC2細(xì)胞增殖能力

向上面細(xì)胞培養(yǎng)的96孔板每孔加入10 μL CCK-8和90 μL無血清的L15培養(yǎng)基, 32℃孵育過夜。用酶標(biāo)儀(Microplate reader)在450 nm處測定各孔的吸光度(OD)值。

1.4 胞內(nèi)、胞外乳酸脫氫酶(LDH)釋放的檢測

糖酵解過程中生成的丙酮酸在LDH的催化下還原為乳酸。LDH試劑盒檢測中: LDH可使1種四唑鹽INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyltetrazolium chloride)轉(zhuǎn)化為強(qiáng)生色的紅色甲瓚, 生成的紅色產(chǎn)物的量與LDH的含量成正比, 在490 nm波長下產(chǎn)生吸收峰, 從而可以通過比色法來定量乳酸脫氫酶的活性。實驗操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。先用4種多肽處理細(xì)胞24h進(jìn)行預(yù)實驗, 確定后續(xù)裂解的細(xì)胞組(樣品最大酶活性孔)。到預(yù)定檢測時間的前1h, 在“樣品最大酶活性對照孔”中加入10 μL LDH釋放試劑、混勻, 孵育。到達(dá)預(yù)定時間后, 將細(xì)胞培養(yǎng)板400 r/min離心5min。取上清液120 μL, 進(jìn)行胞外LDH檢測。細(xì)胞沉淀加入150 μL用PBS稀釋了10倍的LDH釋放工作液試劑(10體積1×PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻), 適當(dāng)搖晃混勻, 32℃孵育1h, 到達(dá)預(yù)定時間后, 400 r/min離心5min, 取120 μL上清用于細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測。分別向胞外和胞內(nèi)LDH檢測樣本中, 加入60 μL LDH檢測工作液(乳酸溶液﹕1×INT溶液﹕酶溶液=1﹕1﹕1), 混勻。室溫避光孵育2h, 用酶標(biāo)儀(Microplate reader)在490 nm測吸光度值。細(xì)胞LDH釋放率=(多肽處理后細(xì)胞上清液OD–對照組細(xì)胞上清液OD)/(最大酶活性組細(xì)胞培養(yǎng)液OD–對照組上清培養(yǎng)液OD)×100%。

1.5 線粒體和溶酶體完整性檢測

將對數(shù)生長期的PAC2斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞用胰酶消化后取細(xì)胞懸液(1×105ind./mL)接種到LAB-TEK板中, 按上述的多肽處理方法用100 μg/mL的4種多肽分別處理PAC2細(xì)胞并培養(yǎng)24h。線粒體和溶酶體染色: 用1×PBS清洗細(xì)胞2—3次, 加入200 μL溶酶體(紅色)和線粒體(綠色)工作液32℃孵育1h。然后棄染色液, 用L15培養(yǎng)基﹕PBS=1﹕1的緩沖液洗滌2次。用TRITC和FITC濾光器的熒光顯微鏡(OLYMPUS TH4-200)觀察細(xì)胞并拍照。

1.6 2-磷酸甘油酸(2-PG)檢測

2-PG的含量是通過將2-PG轉(zhuǎn)化為PEP再轉(zhuǎn)化為丙酮酸來確定的。丙酮酸被氧化, 產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度(Ex/Em=535/587 nm)與2PG含量成正比。利用2-PG試劑盒可以檢測ENO1修飾后的4條多肽對糖酵解代謝的終極產(chǎn)物丙酮酸生成的影響。

先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線: 用975 μL超純水稀釋25 nmol/L(1 mmol/μL)的2-磷酸甘油(2-PG)至工作濃度為25 μmol/L(25 pmol/μL)的2-PG 標(biāo)準(zhǔn)品, 添加0、2、4、6、8和10 μL的2-PG標(biāo)準(zhǔn)品工作液, 使最終濃度為0、50、100、150、200和250 pmol/孔。然后加2-PG Buffer至每個使最終體積為50 μL。用4種多肽處理PAC2細(xì)胞24h后, 將96孔板從培養(yǎng)箱中取出,移走培養(yǎng)基, 用PBS清洗2次。每個孔用50 μL胰酶消化貼壁細(xì)胞3min, 顯微鏡觀察細(xì)胞變圓后加入含10%FBS的L15培養(yǎng)基終止消化, 轉(zhuǎn)移至離心管,1000×g離心3min, 棄培養(yǎng)基。加入100 μL 的1×PBS清洗細(xì)胞。離心沉淀加入200 μL預(yù)冷的2-PG Assay Buffer, 超聲破碎并勻漿, 12000×g離心5min, 將上清液移至另一個新的96孔板中, 每孔中50 μL的熒光反應(yīng)體系混合液, 室溫避光孵育40min。酶標(biāo)儀在Ex/Em=535/587 nm下測熒光值。2-PG濃度C=Sa/Sv(Sa. 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到未知樣品中2-PG的含量; Sv. 檢測的樣品體積)

1.7 RNA提取及PCR Array分析葡萄糖代謝通路

總RNA提取和cDNA合成用0.25%的胰酶消化收集4種不同修飾多肽處理24h后的細(xì)胞懸液,利用TRIzol法提取細(xì)胞total RNA, 并去除基因組DNA; cDNA的合成: 按照TaKaRa公司的PrimeScript?II High Fidelity RT-PCR Kit試劑盒方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR ARRAY利用PCR ARRAY通過Real-Time PCR分析參與葡萄糖代謝過程中84個關(guān)鍵基因的表達(dá)。每個編目的RT2Profiler PCR陣列中包含葡萄糖代謝的84個關(guān)鍵基因和5個管家基因。將上述合成的cDNA用于real-time RT2Profiler PCR Array (QIAGEN, Cat. No. PAZF-006Z)與RT2SYBR?Green qPCR Mastermix(Cat. No. 330529)檢測。將CT值導(dǎo)出到Excel文件, 以創(chuàng)建CT值表。該表隨后上傳至QIAGEN官方數(shù)據(jù)分析門戶網(wǎng)站http://www.qiagen.com/geneglobe, 將樣本分配給對照組和試驗組。從GeneGlobe的QIAGEN門戶網(wǎng)站導(dǎo)出相應(yīng)數(shù)據(jù)分析報告。

1.8 轉(zhuǎn)錄組測序

基于以上結(jié)果, 選取空白對照處理和乙?；揎椂嚯奶幚?4h之后的PAC2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。利用TRIzol法提取total RNA, 由金唯智生物科技有限公司（現(xiàn)改名為“安升達(dá)生命科學(xué)技術(shù)公司”）進(jìn)行RNA-seq測序, 采用Illumina測序平臺完成轉(zhuǎn)錄組測序, 構(gòu)建Illumina PE文庫進(jìn)行150 bp測序。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

我們利用PCR ARRAY通過Real-Time PCR分析了參與葡萄糖代謝過程中84個關(guān)鍵基因的表達(dá)。PCR ARRAY中包含5種管家基因, 基因組DNA污染質(zhì)控。未經(jīng)修飾的ENO1的多肽EG-4作為對照, 采用相對定量法(2–??Ct)分析了葡萄糖代謝通路中基因表達(dá)水平的變化, 通過T-Student計算P值。篩選出變化倍數(shù)在2以上, 具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的差異表達(dá)的基因。利用DAVID對PCR ARRAY葡萄糖代謝通路中差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能富集。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 參考基因組使用的是ENSEMBL,Danio rerio.GRCz11.100, 比對軟件是Hisat2(v2.0.1)默認(rèn)參數(shù), 定量軟件是Htseq(v0.6.1),KEGG使用的是R包里的數(shù)據(jù)庫?；虿町惙治鍪褂肂ioconductor軟件包的DESeq2(V1.6.3)進(jìn)行分析,對檢測的結(jié)果按照差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)(差異基因表達(dá)變化2倍以上且qvalue (fdr, padj)≤0.05)進(jìn)行篩選,統(tǒng)計基因顯著性差異表達(dá)上下調(diào)情況。然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度計算, 并根據(jù)相似度將數(shù)據(jù)進(jìn)行分類,從而將具有相同功能或密切聯(lián)系的基因聚集成類,識別未知基因的功能或已知基因的未知功能, 推斷是否共同參與同一代謝過程或細(xì)胞通路。最后利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)R包里的數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行通路(Pathway)顯著性富集分析, 來確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果

2.1 四種多肽對PAC2細(xì)胞增殖的影響

實驗采用CCK-8評估PAC2細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性。與對照組相比, 甲基化修飾的烯醇化酶肽(EGMe)表現(xiàn)為抑制PAC2細(xì)胞增殖; 乙?；揎椀南┐蓟鸽?EG-Ac)表現(xiàn)為極顯著地促進(jìn)細(xì)胞增殖; 磷酸化修飾的多肽(EG-Ps)也表現(xiàn)為較為明顯地促進(jìn)細(xì)胞增殖; 然而沒有經(jīng)過任何修飾的多肽(EG)對細(xì)胞的作用并不明顯(圖1)。

圖1 烯醇化酶1多肽修飾的處理PAC2細(xì)胞的計量分析Fig. 1 Quantitative analysis of PAC2 cells in different modified enolase peptidesP>0.05(用n表示); 0.010.05 (indicated by n); 0.01

2.2 四種多肽處理對胞內(nèi)和胞外LDH釋放的影響

胞內(nèi)總LDH的含量一方面可以反映細(xì)胞糖酵解代謝生成乳酸的能力, 另一方面能間接反映細(xì)胞數(shù)量的多少。結(jié)果顯示(圖2): 與對照組相比, ENO1的4種多肽處理PAC2后的導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)總LDH的含量均下降, 尤其未修飾肽最顯著。

圖2 24h時PAC2細(xì)胞總LDH的相對含量Fig. 2 Relative content of total LDH in pac2 cells at 24h

胞外LDH的釋放被認(rèn)為是細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo), 通過檢測質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中LDH的活性, 可實現(xiàn)對細(xì)胞膜完整性的定量分析[18]。結(jié)果顯示4種多肽處理后細(xì)胞LDH的釋放量極低,其中釋放最多的EG-Ac處理PAC2細(xì)胞其LDH的釋放率僅為胞內(nèi)LDH的3.953871%, 因此, 修飾后ENO1的4種多肽沒有或很少破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。

2.3 四種多肽處理對2-磷酸甘油酸(2-PG)的影響

2-PG是糖酵解途徑的重要中間代謝產(chǎn)物, 在烯醇化酶(ENO1)的催化下轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸(PEP), 后者又被丙酮酸激酶轉(zhuǎn)化為丙酮酸。本實驗所用2-PG試劑盒是通過2-PG酶轉(zhuǎn)化成PEP,PEP進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成丙酮酸, 通過檢測丙酮酸含量來間接反映2-PG含量。圖 3顯示4種多肽處理后的細(xì)胞生成丙酮酸的量都顯著降低, 而修飾的EG下降更為明顯。實驗結(jié)果顯示4種多肽處理后細(xì)胞內(nèi)2-PG和丙酮酸含量下降, 4種多肽都不同程度地改變了糖酵解代謝途徑或者改變內(nèi)源性烯醇化酶反應(yīng)活性, 特別是修飾EG比未修飾EG改變更為明顯。

圖3 多肽處理24hPAC2 細(xì)胞2-PG的相對含量Fig. 3 Relative content of 2-PG in peptide-treated PAC2 cells at 24h

2.4 四種多肽對線粒體和溶酶體的影響

線粒體和溶酶體結(jié)構(gòu)觀察比較顯示對照組的細(xì)胞線粒體和溶酶體都呈現(xiàn)單層完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu), 經(jīng)過修飾后的4種多肽處理細(xì)胞后溶酶體均呈現(xiàn)不同程度的細(xì)胞粘附團(tuán)(圖4)。經(jīng)過甲基化多肽EG-Me和乙?；揎椀亩嚯腅G-Ac使線粒體發(fā)生聚集, 經(jīng)過磷酸化修飾的EG-Ps及未修飾的多肽EG處理后PAC2細(xì)胞中明顯看到綠色熒光聚集變大變亮, 可見線粒體體積變大, 推測是線粒體發(fā)生了融合的結(jié)果。這些兩種細(xì)胞器的形態(tài)改變也提示氧化磷酸化發(fā)生變化。

圖4 四種多肽對PAC2細(xì)胞線粒體和溶酶體的影響Fig. 4 Fluorescence image of mitochondrion and lysosome staining of PAC2 cell after 4 peptide treatments嵌入圖為細(xì)胞放大圖。左上角標(biāo)尺: 50 μmInsets show magnification of individual cells. Upper left scale bar: 50 μm

2.5 四種多肽對葡萄糖代謝通路的影響

利用PCR ARRAY分析參與葡萄糖代謝過程中84個關(guān)鍵基因的表達(dá)。結(jié)果顯示甲基化修飾的EGMe引起13個基因的表達(dá)上調(diào)和3個基因的表達(dá)下調(diào)。乙?；揎椀腅G-Ac 組有6個基因的表達(dá)上調(diào)和4個基因的表達(dá)下調(diào)。經(jīng)過磷酸化修飾的EGPs組有3個基因的表達(dá)上調(diào)和41個基因的表達(dá)下調(diào)(圖5和表 1)。

圖5 四種多肽對葡萄糖代謝通路中特異性基因表達(dá)的相對表達(dá)水平Fig. 5 Effects of four peptides on relative expression level of specific gene in glucose metabolic pathway

通過DAVID對PCR ARRAY葡萄糖代謝通路中差異表達(dá)的基因富集分析(表1)發(fā)現(xiàn), 甲基化修飾EG-Me和乙酰化修飾EG-Ac處理后的PAC2細(xì)胞,表達(dá)上調(diào)的基因明顯多于下調(diào)的基因。相反, 磷酸化修飾的EG-Ps處理后的PAC2細(xì)胞, 表達(dá)上調(diào)的基因明顯多于下調(diào)的基因。這說明多肽共價修飾不同程度地改變細(xì)胞糖酵解、糖異生、葡萄糖代謝調(diào)控、磷酸戊糖途徑、糖原合成和糖原分解、糖酵解、糖異生等代謝途徑。

表1 糖代謝途徑中差異表達(dá)基因的富集Tab. 1 Enrichment of differentially expressed genes in glucose metabolism pathway

2.6 基因差異表達(dá)和通路分析

為了將糖代謝與細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián), 本文將空白對照處理和乙?；揎椀腅G-Ac處理的PAC2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。按照差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)(差異基因表達(dá)變化2倍以上且qvalue (fdr, padj)≤0.05)進(jìn)行篩選, 統(tǒng)計基因顯著性差異表達(dá)上下調(diào)情況。如圖 6所示, 與對照組相比, 有189個基因顯著性上調(diào),45個基因顯著性上調(diào)?；鹕綀D表示樣本采集有代表性, 差異分析非常明顯。

圖6 乙?；揎桬NO1多肽處理引起PAC2差異表達(dá)基因火山圖Fig. 6 Volcano map of differentially expressed genes induced by acetylation modified eno1 polypeptide in PAC2

將篩選出來的顯著性差異基因從細(xì)胞組分(CC, cellular component)、生物進(jìn)程(BP, biological process)和分子功能(MF, molecular function)三個層面進(jìn)行GO功能顯著性富集分析, 然后采用通過KEGG分析顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(表2和表 3)。

表2 乙?；揎桬NO1多肽處理引起PAC2差異表達(dá)基因KEGG富集分析(疾病相關(guān)的通路)Tab. 2 KEGG Enrichment analysis of PAC2 differentially expressed genes between acetylation modified eno1 polypeptide treatment and non-treatment (disease related pathways)

表3 乙?；揎桬NO1多肽處理引起PAC2差異表達(dá)基因KEGG富集分析(代謝相關(guān)的通路)Tab. 3 KEGG Enrichment analysis of PAC2 differentially expressed genes between acetylation modified eno1 polypeptide treatment and non-treatment (metabolism related pathways)

由圖 7可見, 可顯著富集到30條途徑, MF Term包括ATP結(jié)合、鈣離子結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子調(diào)節(jié)、肌動活動、微管肌動活動、三價鐵運動、NAD+ADP核苷轉(zhuǎn)移酶活性、雙鏈RNA腺苷脫氨酶活性和左手Z-DNA結(jié)合; CC Term包括細(xì)胞內(nèi)、微管、肌球蛋白復(fù)合物、微管相關(guān)復(fù)合物、細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物、微管骨架和脂類粒子; BP Term包括微管為基礎(chǔ)的運動、體節(jié)特異性、抗原處理和內(nèi)源性肽通過MHC-1類抗原呈遞、細(xì)胞鐵離子穩(wěn)態(tài)、ATP分解代謝過程、鐵離子轉(zhuǎn)運、有絲分裂紡錘體定位、ATP合成過程、電子傳遞、膽固醇流出、有絲分裂紡錘體組裝檢查。GO富集結(jié)果顯示, 一些ATP結(jié)合和分解過程和NAD+ADP核苷轉(zhuǎn)移酶活性都受到了影響, 說明乙?；揎椣┐蓟?多肽EGAc可以改變細(xì)胞的能量代謝過程。

圖7 乙?；揎桬NO1多肽(EG-Ac)處理引起PAC2差異表達(dá)基因GO富集分析Fig. 7 Enrichment analysis of pac2 differentially expressed gene go caused by acetylation modified eno1 polypeptide treatmentGO富集柱狀圖。縱坐標(biāo)為富集的GO term, 橫坐標(biāo)為該term中差異基因個數(shù)。不同填充用來區(qū)分生物過程、細(xì)胞組分和分子功能Go enrichment histogram. The ordinate is the enriched GO term, and the abscissa is the number of differential genes in the term. Different filling are used to distinguish biological processes, cellular components and molecular functions

KEGG通路富集分析將富集到的一些DEGs關(guān)聯(lián)到一些相關(guān)的信號通路。與對照組相比, 一些與癌癥和病毒感染相關(guān)的信號通路比較明顯。與疾病相關(guān)的信號通路有人乳頭瘤病毒感染、甲型流感、單純皰疹病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、病毒致癌、肥厚型心肌病(HCM)、丙型肝炎、小細(xì)胞肺癌、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、胰腺癌、microRNA與癌癥、結(jié)直腸癌、癌癥中的蛋白多糖等信號通路。與代謝相關(guān)的信號通路有苯丙氨酸和酪氨酸等多種氨基酸代謝、膽固醇代謝、糖代謝和蛋白質(zhì)代謝等信號通路。所富集的多個代謝通路與PCR array結(jié)果相符。還富集到一些其他的信號通路, 有胞漿DNA感應(yīng)途徑、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、黏著、RIG-Ⅰ樣受體信號通路、ECM受體相互作用、雌激素信號通路等信號通路。

3 討論

3.1 烯醇化酶1不同修飾多肽改變PAC2細(xì)胞生長模式

本文從亞細(xì)胞水平和細(xì)胞代謝水平相互驗證了4種多肽ENO1對PAC2細(xì)胞生長和代謝的影響。首先通過CCK-8細(xì)胞活性檢測, 可以反映4種多肽處理細(xì)胞后細(xì)胞活性和增殖能力, 接著通過胞內(nèi)外LDH釋放實驗檢測糖酵解代謝和細(xì)胞膜完整性, 再用線粒體(綠色)和溶酶體(紅色)專一性染料對4種多肽處理的細(xì)胞進(jìn)行染色, 檢測細(xì)胞器形態(tài)和代謝功能, 然后通過2-PG和PCR Array實驗檢測糖代謝相關(guān)途徑, 最后利用RNA測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深層功能分析。

線粒體和溶酶體對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到重要的作用, 在很多疾病中都觀察到他們的功能缺陷。線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器, 是細(xì)胞氧化磷酸化和ATP合成的主要場所, 線粒體與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療密切相關(guān)[19]。線粒體是一個高度動態(tài)、呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器, 他們通過不斷分裂和融合來調(diào)節(jié)自身動態(tài), 交換線粒體內(nèi)部分子。損傷線粒體可通過與健康線粒體相互融合交換成分, 在一定程度上修復(fù)缺陷, 改善功能[20]。因此線粒體的融合和分裂對線粒體形態(tài)功能都有很大的調(diào)節(jié)作用[21]。溶酶體不僅是細(xì)胞中物質(zhì)的降解中心, 也是一些物質(zhì)代謝過程和細(xì)胞生長的重要代謝傳感器[22]。在線粒體自噬和線粒體應(yīng)激過程中, 線粒體和溶酶體融合來維持線粒體和細(xì)胞的穩(wěn)態(tài); 通過形成線粒體-溶酶體的膜接觸點來維持兩者的動態(tài)平衡[23]。線粒體和溶酶體通過RAB7 GTP酶作用相互交流,對細(xì)胞功能的完整性有重要作用[17]。結(jié)合CCK-8結(jié)果和線粒體形態(tài)的變化表明4種ENO1多肽影響細(xì)胞的生長和代謝狀況, 但只有乙?；揎桬NO1肽EG-Ac促進(jìn)細(xì)胞增殖效果最為明顯。雖然磷酸化修飾多肽EG-Ps和未修飾多肽EG處理后的細(xì)胞對照組相比線粒體發(fā)生了一定程度的融合, 但都沒有增加細(xì)胞膜通透性, 應(yīng)該是改變細(xì)胞代謝的結(jié)果。

3.2 烯醇化酶1不同修飾多肽改變PAC2細(xì)胞糖代謝模式

LDH發(fā)揮作用是Warburg 效應(yīng)的重要一環(huán), 與惡性腫瘤的增殖和侵襲息息相關(guān)[3]。但LDH的具體調(diào)節(jié)通路不清楚。本實驗結(jié)果顯示4種多肽處理后細(xì)胞內(nèi)總LDH的含量均顯著降低。檢測胞外LDH釋放的活性實驗結(jié)果表明4種多肽處理后沒有或很少程度的造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞, 總LDH含量的檢測結(jié)果表明4種多肽處理后均顯著下降, 表明4種多肽處理后細(xì)胞生成乳酸的能力下降。進(jìn)一步的2-磷酸甘油酸檢測發(fā)現(xiàn)4種多肽處理后2-PG含量顯著降低, 結(jié)合LDH檢測結(jié)果, 表明4種多肽可能抑制內(nèi)源性烯醇化酶反應(yīng)活性的能力, 特別是共價修飾后抑制ENO活性。

進(jìn)一步利用PCR ARRAY篩選出差異表達(dá)的基因進(jìn)一步分析了修飾化多肽對糖代謝通路的影響。與對照組相比, 磷酸化修飾多肽EG-Ps處理后細(xì)胞相關(guān)糖代謝通路基因整體上呈現(xiàn)下調(diào)趨勢, 表明磷酸化修飾多肽EG-Ps整體上是抑制細(xì)胞的糖代謝通路。甲基化修飾多肽EG-Me和乙?；揎椂嚯腅G-Ac對細(xì)胞糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)等糖代謝通路都表現(xiàn)出不同程度的調(diào)控作用, 但沒有磷酸化修飾作用明顯。

3.3 乙?；揎椣┐蓟?多肽改變細(xì)胞能量和物質(zhì)代謝模式

PCR ARRAY結(jié)果提示乙?；揎椂嚯腅GAc可以改變細(xì)胞的糖代謝模式, 但可能不是促進(jìn)細(xì)胞增殖的主要原因。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示,GO富集到些ATP結(jié)合和分解過程和NAD+ADP核苷轉(zhuǎn)移酶活性都受到了影響, 說明PAC2細(xì)胞內(nèi)能量代謝發(fā)生了變化, 我們推測乙?；揎椣┐蓟?多肽EG-Ac可以改變PAC2細(xì)胞的能量代謝過程。

轉(zhuǎn)錄組結(jié)合PCR Array檢測結(jié)果顯示, 調(diào)節(jié)磷酸戊糖途徑中的rbks基因表達(dá)上調(diào), rbks基因編碼的蛋白是激酶PfkB家族的一個成員。編碼的蛋白質(zhì)在ATP和Mg2+存在下磷酸化核糖形成核糖-5-磷酸, 參與調(diào)控磷酸戊糖途徑。rbks基因表達(dá)上調(diào)表明乙?；揎椂嚯目赡芗ぐl(fā)磷酸戊糖途徑來增加細(xì)胞的核酸代謝。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果還顯示乙?；揎椂嚯奶幚砗髤⑴c氨基酸代謝和脂類代謝基因明顯富集。我們推測這些代謝可能是乙?；揎椂嚯奶幚砗蟠碳ぜ?xì)胞增殖的代謝機(jī)制。

4 結(jié)論

烯醇化酶(ENO1)是糖酵解途徑的一個重要蛋白酶, 同時也是一個多功能蛋白。本文研究顯示同一個烯醇化酶蛋白肽經(jīng)不同修飾處理后, 對細(xì)胞生長、代謝途徑, 對細(xì)胞線粒體和溶酶體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性都有特異影響。在細(xì)胞水平上, 甲基化修飾多肽表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖、乙?；土姿峄揎棻憩F(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖。EG-Ps總體上抑制糖代謝,而EG-Ac促進(jìn)氨基酸代謝, 脂類代謝和磷酸戊糖途徑促進(jìn)細(xì)胞生長, 并調(diào)控一些疾病如一些癌癥和病毒感染等的發(fā)生發(fā)展過程。不同修飾的ENO1多肽發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制和所調(diào)節(jié)的代謝通路尚未明確, 有待于進(jìn)一步研究。本文采用的研究方法對以后ENO1蛋白以及多肽的多功能研究提供了一個新的思路, 也有助于生物活性多肽功能和營養(yǎng)學(xué)的研究。