越冬饑餓脅迫對草魚機(jī)體生化組成和糖脂蛋白代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

武文一 吉 紅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊凌 712100)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中, 越冬饑餓對于魚類而言是一個自然存在的重大挑戰(zhàn), 其實質(zhì)是長期的不進(jìn)食和低溫的雙重脅迫[1]。為了應(yīng)對季節(jié)變化、產(chǎn)卵遷徙、繁殖及惡劣環(huán)境條件造成的饑餓挑戰(zhàn), 魚類進(jìn)化出了一套精準(zhǔn)的內(nèi)環(huán)境系統(tǒng), 包括激素的分泌,與能量平衡維持相關(guān)的基因的表達(dá)及相對應(yīng)酶的產(chǎn)生[2]。有研究指出, 饑餓對魚體的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、機(jī)體組成成分、血清生化參數(shù)、能量利用、生理調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)乃至相關(guān)代謝酶的調(diào)節(jié)等方面會產(chǎn)生顯著的影響[3]。也有學(xué)者開展了常溫情況下草魚機(jī)體蛋白質(zhì)和脂肪對饑餓脅迫(<60d)的響應(yīng)的研究[4], 但是對于草魚越冬饑餓脅迫(>16周)下, 機(jī)體糖類、脂類和蛋白代謝對越冬饑餓脅迫響應(yīng)的研究還未見報道。

多條中間代謝途徑參與了魚體儲存能量物質(zhì)在饑餓期間動員的過程[5]。一些研究評估了魚類機(jī)體血清代謝物, 如葡萄糖、游離脂肪酸和甘油三酯等含量, 進(jìn)而推斷機(jī)體適應(yīng)饑餓的生理生化進(jìn)程[6]。研究發(fā)現(xiàn), 在饑餓期間不同物種血漿代謝物水平的變化是不同的, 如西伯利亞鱘(Acipenser baerii)饑餓期間血糖水平下降[7], 而真鯛(Pagrus major)饑餓期間的血糖水平保持穩(wěn)定[8]。饑餓導(dǎo)致大西洋鱈(Gadus morhua)血漿游離脂肪酸顯著減少[9], 大口黑鱸(Dicentrarchus labrax)血漿游離脂肪酸則顯著增加[10]。這些血漿代謝物譜的差異可能與魚類種類、年齡、身體狀況和饑餓持續(xù)時間有關(guān)。

饑餓會動員魚體儲存的能量物質(zhì), 如糖原、脂肪和蛋白[11]。據(jù)報道, 在饑餓的最初階段, 許多魚類的肝糖原大量減少, 但大多數(shù)魚類的肝糖原沉積并沒有完全耗盡, 表明存在一種使機(jī)體保持一定量的糖原以備動員的保護(hù)策略[12], 這一策略可能與來自氨基酸和甘油的生糖作用維持肝糖異生有關(guān)。相對于肝糖原, 肌糖原在肌肉中含量較少, 在饑餓過程中甚至可以消耗殆盡[13]。脂質(zhì)是一種重要的能量來源, 在魚體內(nèi)有大量累積[14]。饑餓期間, 一般只有當(dāng)糖原和脂質(zhì)幾乎耗盡時, 蛋白質(zhì)才會被動員起來。但是有些魚類在饑餓期間一直利用脂肪作為主要能量物質(zhì)來源, 而有些魚類在饑餓期間最初動員肌肉蛋白質(zhì)而后動員脂肪[15]。魚類在饑餓期間利用其能量儲備(如糖原、脂肪和蛋白質(zhì))的策略可能與物種特異性有關(guān)。越冬饑餓期間, 草魚機(jī)體能量平衡受到重大挑戰(zhàn), 作為細(xì)胞“能量傳感器”,AMP活化蛋白激酶(AMPK)可以感知能量狀態(tài), 并根據(jù)代謝需要調(diào)節(jié)代謝途徑[16]。前期研究表明, 饑餓能夠改變機(jī)體能量狀態(tài)從而激活A(yù)MPK[17]。越冬饑餓期間, AMPK不同亞型的轉(zhuǎn)錄水平也有著不同的變化趨勢。這說明AMPK在越冬饑餓過程中通過激活下游代謝途徑起著核心調(diào)節(jié)作用, 但AMPK是具體如何激活和調(diào)整下游糖脂蛋白代謝相關(guān)基因的分子反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄水平層面上研究依然欠缺報道。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)作為我國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)淡水魚之一, 其產(chǎn)量居2019年中國養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量榜首, 達(dá)553.3×107kg[18]。草魚在養(yǎng)殖過程中周期性經(jīng)歷越冬饑餓脅迫, 在我國的北方地區(qū)尤其如此。以往的研究多針對草魚常溫饑餓期間生理生化狀態(tài)進(jìn)行探討, 而越冬饑餓期間草魚的相關(guān)研究尚未報道。鑒于此, 為探討草魚應(yīng)對0、1、2、4、8、12和16周的越冬饑餓脅迫, 測定了肌肉常規(guī)成分、血清能量代謝物、組織糖原、甘油三酯含量及AMPK通路下糖脂蛋白代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平, 旨在為闡明越冬饑餓期間草魚維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的潛在機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚取自西北農(nóng)林科技大學(xué)安康水產(chǎn)試驗示范站室外培育池塘, 選擇同一批次養(yǎng)成的商品規(guī)格魚, 挑選大小整齊和健壯的個體作為實驗對象,實驗魚體重(1053.33±16.11) g。同時在室外培育水泥池中馴化2周后開始實驗, 馴化期間每日正常投喂商品飼料(粗蛋白28%和粗脂肪6%)。

1.2 實驗條件和方法

實驗在室外培育水泥池中進(jìn)行(4 m×4 m×1 m),選取8個實驗池, 中間用隔網(wǎng)隔開, 上面架設(shè)遮陽網(wǎng),水深控制0.50 m左右, 水容量8 m3左右。經(jīng)過2周投飼馴化后, 停食1d進(jìn)行分組; 隨機(jī)分為7組, 每組3個重復(fù), 每個重復(fù)15尾魚。當(dāng)水溫自然下降到草魚停止攝食(水溫15℃)時, 實驗開始, 實驗期間水溫最低為4℃, 當(dāng)水溫自然升高到草魚開始重新覓食(水溫15℃)時實驗結(jié)束, 時間從2017年11月10日至2018年3月3日, 此過程即為越冬饑餓期。溫度變化見圖 1。實驗共計7組, 分別為饑餓0(week 0)、1(week 1)、2(week 2)、4(week 4)、8(week 8)、12(week 12)和16周(week 16)。實驗用水為曝氣后井水, 流水環(huán)境, 每2周清污。每日監(jiān)測水溫和水質(zhì),并觀察實驗魚體健康狀況和死亡狀況。實驗用水pH 7.8—8.2, 溶解氧5—6 mg/L, 氨氮<0.1 mg/L, 亞硝酸鹽<0.01 mg/L, 硫化物<0.05 mg/L。

圖1 實驗過程中水溫的變化Fig. 1 The water temperatures during the experiment倒三角為越冬饑餓期間采樣時間點(diǎn)The inverted triangles are the sampling times during overwinter starvation

1.3 樣品采集

采樣程序經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)動物保護(hù)與利用委員會批準(zhǔn), 按照動物福利和道德規(guī)范執(zhí)行。在各實驗組饑餓處理結(jié)束時, 所有魚用50 mg/L MS222麻醉后再對其進(jìn)行取樣。每個平行隨機(jī)抽取2尾魚尾靜脈采血, 4℃冰箱靜置2h, 4℃離心(3000 r/min,15min), 上層澄清透明淡黃色血清速凍于液氮中, 而后轉(zhuǎn)入?80℃冰箱保存, 用作血清代謝物含量指標(biāo)測定; 每個平行隨機(jī)抽取2尾魚在冰盤上解剖取內(nèi)臟團(tuán), 取部分肝胰臟、肌肉和腹腔脂肪組織速凍于液氮中, 后轉(zhuǎn)?80℃冰箱保存。隨后, 在上述分離組織中, 取背部兩側(cè)背鰭后肌肉, 去皮、切除紅肌后, 在?20℃冰箱保存, 用作肌肉常規(guī)成分組成分析。

1.4 測定指標(biāo)和方法

肌肉常規(guī)成分測定包括水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分, 采用AOAC(1995)方法[19]。肌肉水分采用冷凍干燥法測定, 粗蛋白質(zhì)的測定為凱氏定氮法, 粗脂肪采用索氏抽提法, 灰分采用馬福爐灰化法。

肝胰臟和肌肉中糖原(Glycogen)含量使用南京建成生物工程研究所試劑盒(貨號A043)測定, 蛋白質(zhì)濃度使用考馬斯亮藍(lán)染色法試劑盒(貨號A045)進(jìn)行測定。肝胰臟、肌肉、脂肪組織和血清中甘油三酯(TG)含量使用北京普利萊基因技術(shù)有限公司試劑盒(貨號E1013)進(jìn)行測定。血清中甘油(Glycerol)含量使用北京普利萊基因技術(shù)有限公司試劑盒(貨號E1002)進(jìn)行測定, 游離脂肪酸(Free fatty acids)和葡萄糖(Glucose)使用南京建成生物工程研究所試劑盒(貨號A042, 酶法; 貨號: F006-1-1)測定。血清中的魚三磷酸腺苷(ATP)、魚二磷酸腺苷(ADP)和魚一磷酸腺苷(AMP)含量采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海滬峰化工有限公司, 上海市, 中國)進(jìn)行測定(試劑盒的貨號分別是F3805-A, F3808-A和F3806-A)。

1.5 定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

實驗所需引物序列及Gene Bank序列號見表 1。根據(jù)制造商的說明書, 用RNAiso Plus(TaKaRa,Dalian, China)從草魚的肝胰臟、肌肉和脂肪組織中提取總RNA, 并用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(NanoDrop 1000, Thermo Scientific, Wilmington,USA)在260和280 nm處測定RNA完整性。提取純化的總RNA經(jīng)無RNase和DNase處理, 以防止基因組DNA擴(kuò)增。使用PrimeScript??RT 試劑盒(TaKaRa, Dalian, China)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR采用CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules, CA, USA)。每20 μL反應(yīng)含有10 μL 2×SYBR?Premix ExTaq? Ⅱ (TaKaRa, Dalian,China), 7.8 μL滅菌雙蒸餾水(ddH2O), 1 μL 1﹕10稀釋cDNA, 10 mmol/L濃度的正向和反向引物0.6 μL。RT-qPCR程序包括95℃下3min的初始激活步驟, 隨后38個95℃ 15s反應(yīng)、60℃下30s反應(yīng)和65℃下5s反應(yīng)的循環(huán)。β-肌動蛋白用作內(nèi)參基因。PCR后, 通過熔融曲線分析證實了這些反應(yīng)產(chǎn)生的單一產(chǎn)物。如前所述, 根據(jù)公式Ct法(2–??Ct)用于計算基因表達(dá)值[20]。

表1 實時定量PCR引物序列Tab. 1 Real time quantitative PCR primer sequence

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計軟件(19.0版, Chicago, IL, USA)的單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的方式表示。P<0.05為差異顯著。柱狀圖采用Prism 7 軟件(Graph Pad Software Inc., San Diego, USA)進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同越冬饑餓時間對草魚肌肉常規(guī)成分的影響

不同越冬饑餓時間對草魚肌肉常規(guī)成分的影響見表 2。肌肉中水分和粗灰分含量隨越冬饑餓時間延長顯著上升(P<0.05), 粗蛋白含量在越冬饑餓1周后顯著降低(P<0.05), 越冬饑餓1周時肌肉粗脂肪含量顯著上升(P<0.05), 隨后顯著下降(P<0.05)。

表2 不同越冬饑餓時間處理對草魚肌肉常規(guī)成分的影響(%)Tab. 2 Effects of different overwinter starvation treatment on the proximate composition in the muscle of grass carp (%)

2.2 不同越冬饑餓時間對草魚血清代謝物含量變化的影響

如圖 2所示, 所有越冬饑餓處理組血清中葡萄糖含量隨越冬饑餓時間延長顯著降低(P<0.05), 膽固醇含量在越冬饑餓第12周顯著降低(P<0.05), 血清蛋白在第4周開始顯著降低后(P<0.05), 隨著越冬饑餓時間延長, 交替顯著上升后下降再上升至第16周。血清中甘油三酯和甘油含量隨越冬饑餓時間延長顯著降低(P<0.05), 血清游離脂肪酸含量在第2周顯著升高后隨即顯著降低(P<0.05)。

圖2 不同越冬饑餓時間處理對草魚血清代謝物含量變化的影響Fig. 2 Effects of different overwinter starvation treatments on metabolite levels content in serum of grass carp

2.3 不同越冬饑餓時間對草魚組織中糖原及TG含量變化的影響

如圖 3所示, 肝胰臟中糖原含量隨越冬饑餓時間延長顯著降低(P<0.05), 而肌肉中糖原在越冬饑餓第2周顯著降低后(P<0.05)隨即到8—16周顯著升高, 與對照組無顯著差異(P>0.05)。肝胰臟中甘油三酯含量在越冬饑餓4周后顯著下降(P<0.05), 在第12周含量最低; 腹腔脂肪組織甘油三酯含量在越冬饑餓1周后顯著下降(P<0.05), 第2周開始甘油三酯含量無顯著差異變化(P>0.05); 而肌肉甘油三酯含量在越冬饑餓1周顯著上升而后顯著下降(P<0.05)。

圖3 不同越冬饑餓時間處理對草魚各組織中糖原和TG含量變化的影響Fig. 3 Effects of different overwinter starvation treatments on glycogen and TG contents in tissues of grass carp

2.4 不同越冬饑餓時間處理對草魚血清中能量分子含量的影響

如圖 4所示, 草魚血清中ATP含量隨越冬饑餓時間延長顯著降低(P<0.05), ADP和AMP含量隨越冬饑餓時間延長顯著上升而后下降(P<0.05), ADP+AMP/ATP比值隨越冬饑餓時間延長顯著上升(P<0.05)后在第12周后顯著下降(P<0.05)。

圖4 不同越冬饑餓時間處理對草魚血清中ATP、ADP、AMP含量和ADP+AMP/ATP比值的影響Fig. 4 Effects of different overwinter starvation treatments on ATP,ADP, AMP content and ADP+AMP/ATP in serum of grass carp

2.5 不同越冬饑餓時間處理對草魚各組織中ampk α基因表達(dá)量的影響

如圖 5所示, 肝胰臟中ampk α1及ampk α2轉(zhuǎn)錄水平在越冬饑餓第1周最高, 顯著高于其他越冬饑餓處理組(P<0.05); 肌肉中ampk α1及ampk α2轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著升高(P<0.05), 脂肪組織中ampk α1及ampk α2轉(zhuǎn)錄水平第4周最高, 顯著高于其他越冬饑餓處理組(P<0.05)。

圖5 不同越冬饑餓時間處理對草魚各組織中ampk α基因表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of different overwinter starvation treatments on ampk α gene expressions in tissues of grass carp

2.6 不同越冬饑餓時間處理對草魚肝胰臟脂代謝和糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 6所示, 脂肪分解基因atgl、hsl和cpt1α在越冬饑餓處理第1周和第2周轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組及其他處理組(P<0.05), 脂肪合成基因acc和fas轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 脂肪酸膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cd36基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著上升(P<0.05); 糖代謝核轉(zhuǎn)錄因子creb、foxo1和pgc1α轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 糖異生基因pepck和g6pase轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白glut2基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 糖酵解基因gk、pfk和pk轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著上升, 均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖6 不同越冬饑餓時間處理對草魚肝胰臟脂代謝和糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of different overwinter starvation treatments on lipid and glucose related gene expressions in hepatopancreas of grass carp

2.7 不同越冬饑餓時間處理對草魚肌肉脂代謝、糖代謝和蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 7所示, 草魚肌肉脂代謝基因atgl、hsl、cpt1α和cd36轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著上升(P<0.05), 而acc和fas轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 糖代謝核轉(zhuǎn)錄因子creb、foxo1和pgc1α轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 糖異生基因pepck和g6pase轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白glut2基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05); 肌肉中蛋白代謝相關(guān)基因中,gldh基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著上升(P<0.05), 而igf-1、s6k和tor基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05)。

圖7 不同越冬饑餓時間處理對草魚肌肉脂代謝、糖代謝和蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 7 Effects of different overwinter starvation treatmens on lipid, glucose and protein related gene expressions in muscle of grass carp

2.8 不同越冬饑餓時間處理對草魚脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 8所示, 草魚脂肪組織脂代謝基因atgl、hsl、cpt1α和cd36轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著上升(P<0.05), 而acc和fas轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時間延長顯著下降(P<0.05)。

圖8 不同越冬饑餓時間處理對草魚脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 8 Effects of different overwinter starvation treatments on lipid related gene expressions in adipose tissue of grass carp

3 討論

3.1 不同越冬饑餓時間對草魚肌肉常規(guī)成分和血清代謝物含量的影響

魚類在自然界生長過程中, 經(jīng)常面臨饑餓這一種自然生理脅迫[21]。在饑餓脅迫下, 魚體僅能依靠自身營養(yǎng)物質(zhì)的消耗來維持機(jī)體能量代謝平衡[22]。本研究表明, 隨著越冬饑餓時間的增長, 肌肉中粗蛋白和粗灰分含量在第1周后顯著下降, 這是因為機(jī)體蛋白質(zhì)的動員與礦物元素的動員有直接關(guān)系[23];肌肉水分呈現(xiàn)上升趨勢, 可能與越冬饑餓效應(yīng)有關(guān),因為水分的上升也是能量動員的前提條件[24]; 肌肉粗脂肪含量在越冬饑餓第1周達(dá)到最高, 隨后降低。同時也觀察到肌肉中TG有類似的趨勢, 肌肉TG含量在越冬饑餓第1周達(dá)到最高, 這可能因為TG累積在肌肉中貯存為脂質(zhì)的原因[25]。有研究報道, 常溫饑餓14d草魚稚魚肌肉TG含量持續(xù)顯著下降, 與本研究結(jié)果不同的是并未在饑餓第1周達(dá)到最高值而后下降, 這可能與實驗魚規(guī)格或者溫度變化不一致造成, 而且草魚稚魚可能缺乏能從別處調(diào)動的脂肪進(jìn)入肌肉[8]。血清中的甘油和游離脂肪酸是TG分解產(chǎn)物, 隨著越冬饑餓時間的增長, 血清中TG的含量降低, 甘油和游離脂肪酸的含量也隨著顯著下降; 血清TP含量降低表明肝胰臟中蛋白質(zhì)分解和氨基酸代謝的增強(qiáng); GLU含量隨著越冬饑餓時間增長顯著降低, 但未消失, 這可能是肝胰臟和肌肉一直維持糖原合成的重要表現(xiàn)[26], 本研究顯示肝胰臟和肌肉糖原含量顯著下降后呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài), 表明了這一觀點(diǎn), 這與其他作者研究結(jié)果類似[10,27]。上述結(jié)果表明越冬饑餓1周內(nèi)草魚體內(nèi)可能發(fā)生肝胰臟和脂肪組織脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而增加了肌肉脂質(zhì)含量, 同時發(fā)現(xiàn)草魚越冬饑餓階段, 最先動用的能量物質(zhì)是肌肉糖原, 其次才是肝糖原, 而對脂肪的動員從第1周就開始直到越冬饑餓結(jié)束, 但是具有一定的組織特異性, 優(yōu)先度分別是脂肪組織、肌肉和肝胰臟。肌肉蛋白在越冬饑餓第1周就開始顯著下降, 與血清TP變化趨勢一致。這表明草魚肌肉蛋白在越冬饑餓第一周就進(jìn)行了動員, 這與前人研究結(jié)果一致[4]。

葡萄糖是許多組織的必需能源物質(zhì)[28], 因此,草魚在饑餓期間必須維持血糖穩(wěn)態(tài)。饑餓脅迫下的血糖水平變化很大。越冬饑餓7d后, 草魚的血糖水平顯著下降, 結(jié)果與大口黑鱸(Dicentrarchus labrax)變化一致[29], 這是由于在能量匱乏期間葡萄糖動員進(jìn)行了供能。此外, 為了在長期饑餓期間滿足代謝要求并保持穩(wěn)定的葡萄糖水平, 還可能激活糖原分解或從頭合成葡萄糖(糖異生)[30]。糖原作為維持饑餓期間血糖的來源具有物種特異性[28,31—33]。在本研究中, 肌糖原首先被動員, 越冬饑餓第4周肝糖原才被動員, 這表明, 草魚在越冬饑餓期間, 肌糖原首先被用作維持葡萄糖水平, 這與大多數(shù)魚類類似[7]。肝糖原在饑餓期是保守的, 在越冬饑餓第4周才觀察到顯著的下降, 這意味著肝胰臟中的糖原消耗比肌肉中的糖原少, 盡管肝糖原含量要遠(yuǎn)高于肌糖原。但是在越冬饑餓第8周之后, 肌糖原出現(xiàn)緩慢回升直到正常水平, 肝糖原含量則一直下降, 表明肌糖原作為草魚越冬饑餓期間主要供能物質(zhì)作用要強(qiáng)于肝糖原。因此, 草魚的肝胰臟和肌肉對越冬饑餓的反應(yīng)策略是不同的。脂肪作為能量密度最高的能源物質(zhì)[31], 在魚類長期饑餓過程中, 起主要供能作用[3]。本研究表明在越冬饑餓期間, 脂肪組織首先動員, 其次是肌肉和肝胰臟, 而作為機(jī)體重要的運(yùn)動器官, 肌肉在越冬饑餓第1周粗脂肪含量和TG含量顯著上升, 表明肌肉是機(jī)體消耗能源的主要部位[34]。肝胰臟中TG含量在越冬饑餓第4周變化趨勢與肝糖原一致, 表明作為機(jī)體能量動員中轉(zhuǎn)站, 也在發(fā)揮著維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)作用。血清中TG和TCHO含量, 與魚的營養(yǎng)狀況密切相關(guān)[35], 其代謝產(chǎn)物如甘油、游離脂肪酸和脂蛋白的含量通常被用來推斷饑餓期間的脂質(zhì)動員。隨著饑餓時間的延長, 血清中TP和TG含量顯著下降, 甘油和游離脂肪酸含量顯著上升, 表明脂質(zhì)動員水平在持續(xù)運(yùn)行中。

3.2 不同越冬饑餓時間處理對草魚各組織中AMPK α基因及其下游相關(guān)脂代謝、糖代謝和蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

本團(tuán)隊前期研究表明, 越冬饑餓會顯著改變草魚機(jī)體肝胰臟、肌肉和脂肪組織ampk的表達(dá)水平[36]。為了闡明其在越冬饑餓期間能量調(diào)控潛在機(jī)制, 本研究系統(tǒng)地分析了血清及肝胰臟、肌肉、脂肪組織代謝產(chǎn)物的同時, 對ampk基因及其相關(guān)聯(lián)的參與中間代謝反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄水平也進(jìn)行了檢測, 圖 9對上述轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果進(jìn)行了過程示意。隨著越冬饑餓時間的延長, 血清中ADP+AMP/ATP比值顯著上升, 肝胰臟、肌肉和脂肪組織ampk的表達(dá)水平均表現(xiàn)了上升的趨勢, 隨后變化不一, 表明越冬饑餓激活了ampk基因表達(dá)[37—39]。在肝胰臟和肌肉中,隨著越冬饑餓的進(jìn)行,ampk基因激活糖酵解相關(guān)基因pfk, 同時加速了gk和pk的轉(zhuǎn)錄水平的提高, 促進(jìn)了糖酵解[40]。在肝胰臟和脂肪組織中,ampk基因可直接磷酸化并促進(jìn)atgl基因表達(dá)[41], 進(jìn)而促進(jìn)脂解,加速下游脂解基因hsl的表達(dá), 同時磷酸化并促進(jìn)acc基因表達(dá), 抑制其活性[42], 降低了乙酰CoA轉(zhuǎn)變成丙酰CoA, 間接降低了丙酰CoA對cpt-1α基因表達(dá)的抑制, 加速了脂肪酸的β-氧化[43,44], 同時抑制acc下游基因fas的表達(dá), 降低脂質(zhì)合成[45]。ampk還能夠直接激活cd36的表達(dá)水平[46], 促進(jìn)胞外游離脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[47], 進(jìn)而促進(jìn)了脂肪酸的β-氧化。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(creb), 過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(pgc-1α), 叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(foxo1)是ampk調(diào)控糖異生關(guān)鍵限速酶g6pase和pepck的重要轉(zhuǎn)錄因子,ampk經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2降低creb的轉(zhuǎn)錄水平, 同時降低pgc-1α和foxo1的表達(dá), 進(jìn)而降低g6pase和pepck的生成, 降低糖異生。同時,ampk對抑制glut2的表達(dá)也有報道[48], 進(jìn)一步降低糖異生的發(fā)生。在肌肉中, 激活的ampk可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分解, 維持機(jī)體能量代謝平衡。ampk與tor之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系,ampk基因表達(dá)水平提高后抑制tor表達(dá), 進(jìn)而抑制s6k表達(dá), 降低蛋白質(zhì)合成, 這與前人報道相類似[49]。然而, 以上結(jié)果僅僅依賴于基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)是具有局限性的。這些基因最終的功能需要轉(zhuǎn)錄翻譯后并進(jìn)行重要修飾, 因此與AMPK通路相關(guān)的糖脂蛋白代謝基因的功能需要進(jìn)一步的研究。

圖9 越冬饑餓處理下草魚能量代謝示意圖: 基于AMPK及其下游通路相關(guān)基因Fig. 9 Energy metabolism of grass carp under overwintering starvation treatment: based on the AMPK and its downstream pathway related genes乙酰輔酶A. Acetyl-CoA; 丙二酰輔酶A. Malonyl-CoA; 脂肪酸. FA; 三酰基甘油酯. TAG; 二?；视王? DAG; 單酰基甘油酯. MG; 葡萄糖. Glucose; 丙酮酸. Pyroracemic acid; 草酰乙酸. Oxaloacetate; 磷酸烯醇丙酮酸. Phosphoenolpyruvate; 葡萄糖-6-磷酸. Glucose-6-phosphate; 甘油. Glycerol; 脂質(zhì)攝取. Lipid uptake; 脂肪酸β-氧化. Fatty acids β-oxidation; 糖酵解. Glycolysis; 糖異生. Gluconeogenesis;蛋白質(zhì)降解, Protein degradation

4 結(jié)論

綜上所述, 越冬饑餓對草魚的糖、脂、蛋白代謝有顯著影響。肌糖原和肝糖原的持續(xù)消耗, 及糖酵解和糖異生的相互運(yùn)行, 有助于維持草魚在越冬饑餓期間的血糖水平; 通過促進(jìn)脂肪、蛋白質(zhì)分解和脂肪酸β-氧化過程, 及抑制脂肪酸合成來維持能量平衡。此外, 草魚在動員能量方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)先次序、敏感性和組織特異性。其中, 通過激活A(yù)MPK通路及促進(jìn)或抑制其下游相關(guān)基因表達(dá), 增強(qiáng)能量供應(yīng)降低能量消耗, 促使越冬饑餓期間機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)的維持。本研究提供的信息可用于制定有效的草魚越冬前后投喂策略, 針對草魚期間能量物質(zhì)代謝情況, 可在越冬前后投喂飼料中適當(dāng)調(diào)整脂肪作為最重要的供能物質(zhì), 同時推動草魚在越冬養(yǎng)殖期間管理者做出更加適當(dāng)?shù)臎Q策, 以期改善草魚越冬前后的存生產(chǎn)效率。