果膠高載引起的黃顙魚綠肝癥和肝纖維化與腸道菌群失調(diào)的關(guān)聯(lián)

姚仕彬 任勝杰 蔡春芳 曹霞敏 吳 萍 葉元土 姜光明 丁惠明 張 鋮

(1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 蘇州 215123; 2. 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘇州 215123;3. 蘇州市吳中區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 蘇州 215104; 4. 蘇州市陽澄湖國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司, 蘇州 215138)

植物性食物或飼料中含有豐富的不能被單胃動(dòng)物消化吸收的碳水化合物, 即膳食纖維, 包括非淀粉多糖(纖維素、半纖維素、果膠、樹膠和β-葡聚糖等)、抗性淀粉、抗性低聚糖及木質(zhì)素等[1]。膳食纖維雖然不能被單胃動(dòng)物消化吸收, 但會(huì)影響腸道環(huán)境, 同時(shí)膳食纖維也是腸道細(xì)菌的能源, 能夠促進(jìn)腸道細(xì)菌的增殖, 提高其活力[1—3]。

腸道細(xì)菌在維持宿主代謝穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[4,5], 其結(jié)構(gòu)和功能的改變可能導(dǎo)致宿主代謝失調(diào), 進(jìn)而發(fā)展成各種疾病[3,6]。適度提高日糧膳食纖維含量可改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能, 因此, 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域正嘗試用某些種類膳食纖維操控腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能, 以達(dá)到改善健康的目的[7,8]。

植物性蛋白源中膳食纖維含量往往達(dá)30%以上, 例如, 豆粕中膳食纖維含量達(dá)36.7%[9], 豆渣中膳食纖維更是高達(dá)63%[10]。隨著低魚粉、無魚粉飼料的開發(fā)和應(yīng)用, 養(yǎng)殖魚類往往處于膳食纖維高載狀態(tài), 這可能會(huì)引起腸道菌群功能紊亂, 進(jìn)而發(fā)展出各種疾病。Singh等[11]已發(fā)現(xiàn), 膳食纖維高載可導(dǎo)致小鼠膽汁淤積, 并誘發(fā)肝癌。我們?cè)谇捌谘芯恐幸沧⒁獾缴攀忱w維短期高載(7d)可導(dǎo)致黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)綠肝癥, 長(zhǎng)期高載(56d)引起肝纖維化[12]。但腸道菌群是否參與了這一病理過程尚不清楚。本研究通過向黃顙魚飼料中添加甲硝唑來抑制腸道厭氧菌, 探討腸道菌群在膳食纖維高載致病過程中發(fā)揮的作用, 為進(jìn)一步解析膳食纖維的生理效應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料制備

所用果膠(食品級(jí)>99%, 酯化度75%, 黏度1200 mPa)購自鄭州明瑞化工有限公司, 用于抑制腸道厭菌群的甲硝唑(Metronidazole)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑蘇州有限公司(純度≥99%)。其他飼料原料均由鑫裕飼料蘇州有限公司提供。向飼料中分別添加30%的糊精和果膠, 命名為CON和PEC飼料。再向這兩種飼料中分別添加0.2%的甲硝唑, 配制成名為CONM和PECM的飼料。飼料配方見表 1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab. 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (airdry basis)

1.2 實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在蘇州市陽澄湖國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司研究生工作站進(jìn)行。黃顙魚幼魚購自浙江省湖州市南潯某育苗場(chǎng)。在室內(nèi)水泥池馴化后選取規(guī)格一致的黃顙魚隨機(jī)分到24個(gè)容積為400 L的PC養(yǎng)殖缸中, 每缸放魚20尾, 再用CON飼料馴養(yǎng)2周, 確保攝食狀態(tài)良好。2周后稱重[初始體質(zhì)量(21.5±3.6) g], 并將各缸魚初重差異調(diào)至CV<3%。隨機(jī)分組, 分別投CON、PEC、CONM和PECM飼料, 每種飼料投喂6缸魚。日常管理和環(huán)境條件同Ren 等[16]。

1.3 采樣及樣品分析

于飼喂7d和56d后采樣, 采樣于禁食12h時(shí)進(jìn)行。試驗(yàn)魚先用200 mg/L的MS-222麻醉, 隨機(jī)選取6尾魚用于采血, 制備血清, 用于血清總膽汁酸(TBA)濃度測(cè)定(寧波美康生物科技股份有限公司生產(chǎn)的血清總膽汁酸測(cè)定試劑盒)。每箱3尾魚于無菌狀態(tài)下取腸道內(nèi)容物(指腸道中未被吸收的消化物), 采用試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司, 中國)測(cè)定膽鹽水解酶(BSH)活性; PEC組和PECM組后腸內(nèi)容物也用于腸道菌群結(jié)構(gòu)分析, 以驗(yàn)證飼料中甲硝唑的有效性。腸道菌群采用16S rRNA 法分析, 先用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒(Omega, 美國)按其說明書抽提DNA,將提取的 DNA 樣品送往蘇州金維智生物科技股份有限公司進(jìn)行建庫和擴(kuò)增, V3+V4區(qū)高通量測(cè)序。飼養(yǎng)56d后的魚每箱取3尾, 解剖取其肝臟, 甲醛固定后制作石蠟切片, 用masson染色觀察肝臟纖維化程度。其余的魚解剖, 取肝組織液氮速凍后–80℃冰箱保存, 用于FXR、CYP7A1、CYP27A1、ABCB11和NTCP等參與膽汁酸調(diào)控、合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因的表達(dá)分析, 方法同Ren等[13]。所有的魚均用于綠肝率的統(tǒng)計(jì), 方法同Cai等[12], 即由3名視覺正常的實(shí)驗(yàn)者觀察后一致認(rèn)為肝臟局部或全部有肉眼可見的膽汁樣綠色時(shí), 將其記錄為綠肝魚, 綠肝率(%)=綠肝魚的數(shù)量/每缸魚數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值mean±SD表示。各處理間差異經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行Duncan多重比較, 統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 19.0, 顯著水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 甲硝唑有效性驗(yàn)證

對(duì)PEC組和PECM組黃顙魚腸道內(nèi)容物行16S rRNA V3+V4區(qū)高通量測(cè)序分析, 在黃顙魚腸道中共發(fā)現(xiàn)20個(gè)門的細(xì)菌(圖1)。PEC組在飼養(yǎng)7d后豐度較高的為變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes), 分別約占32%、42%和17%, 而PECM組變形菌門豐度最高,約占87%。飼養(yǎng)56d后, PEC組梭桿菌門占比升至85%, PECM組仍以變形菌門為第一優(yōu)勢(shì)菌門, 豐度約占92%。上述結(jié)果表明飼料中添加的甲硝唑使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變, 厭氧菌大幅度減少。

圖1 甲硝唑?qū)δc道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Metronidazole on the composition of intestinal flora of yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco

2.2 綠肝率

由圖 2可知, CON組黃顙魚在7d和56d均無綠肝出現(xiàn)。飼喂7d時(shí)CONM組綠肝率達(dá)12%, 顯著高于CON組(P<0.05)。PEC組和PECM組均出現(xiàn)綠肝癥狀, 但后者的綠肝率(88%)約為前者(27%)的3倍。飼喂56d后綠肝率均較低, 且各組間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同日糧飼喂黃顙魚7d和56d后綠肝率Fig. 2 The incidence rate of green liver in yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 7d and 56d respectively同一系列柱上的小寫字母不同表示組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,n=3); 下同Different letters above the bars of the same series mean significantly different (P<0.05, n=3). The same applies below

2.3 肝組織學(xué)

飼養(yǎng)56d后, 肝組織切片masson染色結(jié)果顯示,CON組纖維化(藍(lán)色信號(hào))不明顯而PEC組纖維化明顯。總體上, 纖維化程度由高到低依次為PECM組>PEC組>CONM組> CON組(圖3)。

圖3 攝食不同飼料56d后黃顙魚肝組織masson染色切片照Fig. 3 Masson stained sections of liver tissue of yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 56d

2.4 膽鹽水解酶活性和血清總膽汁酸濃度

由圖 4可知, 7d時(shí), CONM和PEC組腸道內(nèi)容物BSH活性均顯著低于CON組(P<0.05); PECM組顯著低于PEC組(P<0.05)。56d時(shí), CONM組和PEC組BSH活性均顯著低于CON組(P<0.05), PECM組低于PEC組但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同日糧飼喂黃顙魚7d和56d后腸道內(nèi)容物中膽鹽水解酶活性和血清總膽汁酸濃度Fig. 4 The digesta bile salt hydrolase (BSH) activity and serum total bile acid concentration of yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 7d and 56d respectively

7d時(shí)PEC組血清TBA濃度顯著高于CON組(P<0.05), 而CONM和PECM組顯著低于CON組(P<0.05)。56d時(shí), CONM組、PEC組和PECM組血清TBA濃度顯著高于CON組(P<0.05), 且各組間差異顯著, 由高到低為CONM組>PEC組>PECM組>CON組(P<0.05)。

2.5 肝臟膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控基因表達(dá)

由圖 5可見, 同CON組相比, PEC組7d后肝臟中fxr、cyp7a1和ntcp基因表達(dá)顯著升高(P<0.05),cyp27a1和abcb11基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)。CONM組fxr、cyp7a1、cyp27a1、abcb11和ntcp基因表達(dá)均顯著高于CON組(P<0.05)。同PEC組相比, PECM組fxr基因表達(dá)顯著降低(P<0.05),cyp27a1和ntcp基因表達(dá)顯著升高(P<0.05)。56d時(shí)PEC組fxr、cyp7a1、cyp27a1和abcb11基因表達(dá)顯著低于CON組(P<0.05),ntcp無顯著變化。CONM組fxr和cyp27a1表達(dá)也顯著低于CON組(P<0.05),cyp7a1、abcb11和ntcp表達(dá)則顯著高于CON組(P<0.05)。同PEC組相比, PECM組fxr和ntcp表達(dá)無顯著差異(P>0.05),cyp7a1、cyp27a1和abcb11基因表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖5 不同日糧飼喂黃顙魚7d (A)和56d (B)后肝臟膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)Fig. 5 Relative mRNA expression of genes related to liver bile acid synthesis, transport and regulation in the liver of yellow catfish,Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 7d (A) and 56d (B)

3 討論

3.1 甲硝唑的抑菌作用

由PEC組和PECM組腸道菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可見, 添加甲硝唑后變形菌門豐度提高, 而厚壁菌門和梭桿菌門的豐度下降。這一結(jié)果與甲硝唑?qū)Π唏R魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響一致[14], 表明本研究中添加的甲硝唑沒有在飼料制備過程中被完全破壞, 發(fā)揮了抑制腸道厭氧菌的作用。

3.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)與綠肝癥和肝纖維化的關(guān)聯(lián)性

本研究結(jié)果顯示, 7d時(shí)CON組沒有綠肝癥出現(xiàn), 但CONM組有12%的魚出現(xiàn)了綠肝癥, PECM組綠肝率則是PEC組的3倍。上述結(jié)果暗示腸道菌群失調(diào)可能是綠肝癥的重要原因。綠肝癥是肝汁淤積的表現(xiàn)[12,15]。秦艷等[16]和李紅等[17]分析了肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒腸道菌群, 發(fā)現(xiàn)患兒腸道菌群紊亂,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

7d 時(shí)PECM組變形菌門豐度達(dá)到了87%, 遠(yuǎn)高于PEC組(圖1)。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因應(yīng)該與果膠自身對(duì)腸道菌群的影響有關(guān): 研究表明高果膠飲食也會(huì)提高腸道變形菌門的相對(duì)豐度[18], 從而與甲硝唑的作用相疊加, 最終導(dǎo)致PECM組變形菌門成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌(圖1)。PECM組綠肝率較PEC組高3倍,這是否與變形菌門豐度提高有關(guān)值得關(guān)注。飼養(yǎng)56d時(shí)各組魚綠肝率均較低(圖2), 這一結(jié)果與我們的前期研究一致[12], 可能與體內(nèi)膽固醇[12]、牛磺酸[19,20]等膽汁成分及其合成原料的下降有關(guān)。

長(zhǎng)期膽汁淤積可損傷肝細(xì)胞, 繼而發(fā)展為肝纖維化[15]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn), 與CON組相比,PEC組黃顙魚的肝組織發(fā)生了明顯的纖維化[12], 這一現(xiàn)象在本實(shí)驗(yàn)中得到重現(xiàn)(圖4)。結(jié)合各組綠肝率的差異, 表明黃顙魚肝纖維化也與膽汁淤積有關(guān),而纖維化后肝臟功能障礙則可能是56d時(shí)綠肝率反而較低的另一原因。

3.3 腸道菌群引起綠肝癥和肝纖維化的潛在分子機(jī)制

腸道菌群在膽汁酸代謝中發(fā)揮著重要作用, 它借助BSH和類固醇脫氫酶等通過脫氫、脫羥基和脫硫等作用改變膽汁酸池的組成[21—23], 本研究結(jié)果顯示, 添加甲硝唑后BSH活性顯著下降, PEC組BSH活性顯著低于CON組, 表明其膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化效能下降。膽汁酸是法尼醇X受體(FXR)的配體,不同膽汁酸對(duì)FXR的激活作用不同甚至相反[24],FXR又影響著膽汁酸的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)[25]。膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶, 甾醇27α-羥化酶(CYP27A1)則是替代途徑的限速酶。由本研究結(jié)果可見, 7d時(shí)CONM組、PEC組和PECM組的fxr和CYP7A1表達(dá)均高于CON組, 此外, CONM組和PECM組的cyp27a1也顯著高于CON組(P<0.05, 圖 5), 表明fxr高表達(dá)未能有效抑制膽汁酸合成。Na+/?；悄懰釁f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體 (NTCP) 是一種表達(dá)于肝細(xì)胞基側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 將肝門靜脈內(nèi)的牛磺膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)。NTCP缺陷病的共同臨床特點(diǎn)是高膽汁酸血癥[26]。本研究中7d 時(shí)PEC組血清TBA濃度較高, 56d時(shí)CONM組TBA含量較高, 然而, 其對(duì)應(yīng)的ntcp表達(dá)也均較高, 因此不能用它解釋血清TBA的變化。abcb11編碼膽鹽輸出泵(BSEP), BSEP是肝臟從血液中清除膽汁酸鹽的限速步驟[27]。當(dāng)BSEP蛋白功能異?；虮磉_(dá)減少時(shí), 阻礙膽汁酸外排至膽管, 從而造成肝內(nèi)膽汁淤積[28]。從本研究結(jié)果看, CONM組在56d時(shí)abcb11表達(dá)量最高(圖5), 但其血清TBA含量也最高(圖4)。上述結(jié)果表明與CON組相比, CONM、PEC和PECM組的魚均存在膽汁酸代謝紊亂的情況。大量研究表明腸道菌群失調(diào)會(huì)引起膽汁酸代謝紊亂[21,22],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相支持。腸道內(nèi)的膽汁酸除了乳化脂肪促進(jìn)其吸收外, 還具有信號(hào)傳導(dǎo)功能, 通過FXR、G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體等調(diào)節(jié)膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及炎性反應(yīng)[29,30], 腸道菌群失調(diào)后膽汁酸代謝紊亂, 這可能是果膠高載引起綠肝癥和肝組織纖維化的重要途徑。

4 結(jié)論

本研究再次證明果膠短期高載可致綠肝癥, 長(zhǎng)期高載則會(huì)引起肝組織纖維化。飼料中添加甲硝唑提高了綠肝率和肝臟纖維化程度, 提示腸道菌群紊亂可能是綠肝癥和肝纖維化的重要原因, 這一病理過程可能由膽汁酸介導(dǎo)。