豬SREBP-1c 基因表達(dá)譜及其對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

盧清俠，王歐陽，張 彬，王 璟，陳俊峰，馬 強(qiáng)，張家慶，任巧玲，邢寶松，曹 海

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2. 三門峽市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 三門峽 472000；3. 河南興銳農(nóng)牧科技有限公司，河南 信陽 465550）

豬肉是我國居民消費(fèi)量最大的肉品，近些年來我國豬肉產(chǎn)量整體呈增長趨勢[1]?！笆奈濉逼陂g，我國生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略之一是“提質(zhì)保供”，聚焦提升生豬肉質(zhì)性狀[2]。肌內(nèi)脂肪含量是重要的肉質(zhì)性狀之一，直接影響肉的風(fēng)味、多汁性、嫩度、色澤等。在一定范圍內(nèi)提高肌內(nèi)脂肪含量，有助于提高豬肉的感官品質(zhì)和食用品質(zhì)[3]。近年來，關(guān)于豬肉品質(zhì)改良的研究逐漸細(xì)化到提高肌內(nèi)脂肪含量，肌內(nèi)脂肪含量受遺傳和環(huán)境影響，其中品種、性別等遺傳因素影響更大[4]。日本和牛背最長肌肌內(nèi)脂肪含量高達(dá)36.5%，在世界所有牛種中排名第一，與母牛相比，公牛肌內(nèi)脂肪含量更高[5]；閹公豬較完整公豬肌內(nèi)脂肪含量高[6]。肌內(nèi)脂肪含量遺傳力較高，在不同物種中高達(dá)0.36～0.81，提示肌內(nèi)脂肪含量易于遺傳改良[7]。因此，研究肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制，對提高肉質(zhì)、滿足消費(fèi)者需求有重要意義。

肌內(nèi)脂肪含量性狀是數(shù)量性狀，受微效多基因調(diào)控，目前報(bào)道的與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)的基因有過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（Peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPARγ）基因、脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid?binding proteins，F(xiàn)ABP）基因、脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）基因、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（Sterol regulatory element binding proteins?1c，SREBP-1c）基因、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的 DFFA 樣 效 應(yīng) 因 子 C（Cell death?inducing DFF45?like effector C，CIDEC）基因、激素敏感酯酶（Hormone sensitive lipase，HSL）基因、瘦素（Leptin）基因等[8]。其中SREBP-1c基因又稱為脂肪細(xì)胞定向和分化因子1（Adipocyte determination and differentiation factor?1，ADD-1）基因，SREBP-1c蛋白是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，對脂肪細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)控作用[9]。SREBP-1c不僅可與PPARγ、CCAAT 元件增強(qiáng)結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer binding proteins alpha，C/EBPα）基因互作，調(diào)控成脂分化，還可調(diào)節(jié)葡萄糖、脂肪酸和甘油三酯（Triglyceride，TG）代謝相關(guān)酶的表達(dá)，其靶基因包括乙酰輔酶A 羧化酶（Acetyl coA carboxylase，ACC）[10]、脂 肪 酸 合 成 酶（Fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）[11]、低密度脂蛋白受體（Low?density lipoprotein receptor，LDLR）[12]、葡 萄 糖 激 酶（Glycerol kinase，GK）[13]、磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 激 酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）[14]等與脂肪合成及葡萄糖代謝相關(guān)基因。

前期研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1c基因與豬[15]、牛[16]、羊[17?18]、雞[19]、鴨[20?21]等畜禽脂肪沉積相關(guān)。SREBP-1c第2 外顯子區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)顯著影響烏金豬和長白豬肌內(nèi)脂肪含量（P<0.05）[22]；大河烏豬SREBP-1c基 因Eam1104I-RFLP 位 點(diǎn)，HH 型 個(gè)體肌內(nèi)脂肪含量顯著高于HT 和TT 型個(gè)體（P<0.05），HH 型個(gè)體肌肉失水率顯著高于HT 型個(gè)體（P<0.05）[23]；SREBP-1c基因84 bp 位點(diǎn)處插入/缺失與棕櫚油酸、硬脂酸和甘油三酯及C16 脂肪酸不飽和指數(shù)顯著相關(guān)（P<0.05）[24]。CUI 等[25]對比萊蕪豬和大白豬背最長肌差異表達(dá)mRNA和lncRNA，發(fā)現(xiàn)SREBP-1c作為lncRNA 靶基因，與肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)。這些關(guān)聯(lián)分析結(jié)果均提示，在DNA水平上SREBP-1c的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)。徐麗等[26]在牛胎兒骨骼肌成纖維細(xì)胞中過表達(dá)SREBP-1c，發(fā)現(xiàn)SREBP-1c可促進(jìn)脂質(zhì)生成；尹雯雯等[27]在骨骼肌細(xì)胞中過表達(dá)SREBP-1c，發(fā)現(xiàn)SREBP-1c可抑制胰島素信號通路，參與肌細(xì)胞的胰島素抵抗；高曉娟等[28]通過免疫共沉淀證明，在豬脂肪細(xì)胞分化過程中SREBP-1c 可與PGC-1β 結(jié)合，參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。但目前關(guān)于SREBP-1c在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的功能驗(yàn)證較少。為此，擬利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（Real?time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測SREBP-1c在豬不同育肥階段組織表達(dá)譜，并在豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，利用RNA 干擾、油紅O 染色和RT-qPCR 技術(shù)，分析抑制SREBP-1c表達(dá)對肌內(nèi)脂質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響，旨在為研究SREBP-1c對豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步將其應(yīng)用于肉質(zhì)性狀選育提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室分離凍存；SREBP-1c和對照組（control）的干擾RNA（siRNA）由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；RNAiso Plus 試 劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa 公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液均購自Gibco 公司；青鏈霉素、LipofectamineTM3000 購自Invitrogen 公司；胰 島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松購自Sigma 公司；油紅O 染色液購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 樣品采集

隨機(jī)挑選12頭淮南豬仔豬，按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)程序（NY/T 65—2004）在河南興銳農(nóng)牧科技有限公司進(jìn)行飼養(yǎng)。在體質(zhì)量達(dá)到30 kg（育肥前）、75 kg（育肥中）和110 kg（育肥后）時(shí)，每個(gè)階段隨機(jī)選擇3 頭豬進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。屠宰30 min 內(nèi)，采集皮下脂肪和背最長肌組織樣品，迅速置于液氮冷凍，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室備用。

1.3 總RNA提取及cDNA制備

取出液氮保存的淮南豬背最長肌和皮下脂肪組織，在預(yù)冷研缽中迅速研磨成粉末，加入RNAiso Plus，提取總RNA。主要流程包括裂解、相分層、沉淀、洗滌、干燥、溶解。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA完整性，使用Nano-Drop 2000紫外分光光度計(jì)分析每個(gè)樣品RNA 的純度和濃度。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒合成cDNA。

1.4 RT-qPCR

根據(jù)SREBP-1c、PPARγ、C/EBPα、FAS、FABP4、CIDEC、GAPDH基 因 序 列 設(shè) 計(jì)RT-qPCR 引 物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒檢測SREBP-1c在淮南豬不同育肥階段背最長肌和皮下脂肪的表達(dá)量，以及在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞干擾SREBP-1c表達(dá)后，PPARγ、C/EBPα、FAS、FABP4、CIDEC基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為25μL，包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL、cDNA 模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、ddH2O 8.5μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量[29]。

表1 RT-qPCR相關(guān)引物序列Tab.1 Primers used in RT-qPCR

1.5 豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及處理

豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室分離凍存，具體分離過程見文獻(xiàn)[30]。從液氮取出凍存細(xì)胞，37 ℃迅速解凍，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合率為80%左右時(shí)，首先篩選SREBP-1c不同siRNA 的干擾效率及最佳干擾濃度。按50 nmol/L和75 nmol/L 濃度，使用LipofectamineTM3000 分別轉(zhuǎn)染SREBP-1csiRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）及Ctrl siRNA。轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，提取RNA，采用RT-qPCR 技術(shù)檢測SREBP-1c的相對表達(dá)量，篩選干擾效果最佳的siRNA 及其作用濃度。按照篩選結(jié)果轉(zhuǎn)染豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 收集細(xì)胞，提取RNA，檢測SREBP-1c互作基因及脂質(zhì)沉積相關(guān)基因表達(dá)量；轉(zhuǎn)染待細(xì)胞完全匯合2 d 后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ（完全培養(yǎng)基添加10μg/mL 胰島素、1μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IBMX）培養(yǎng)2 d，再使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ（完全培養(yǎng)基添加10μg/mL 胰島素）培養(yǎng)至第8 天，每2 d 更換一次培養(yǎng)基。

1.6 油紅O染色

誘導(dǎo)分化第8 天進(jìn)行油紅O 染色。棄去培養(yǎng)基，用PBS 沖洗3 遍；使用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗3 遍；油紅O 工作液染色60 min，棄去染色液用PBS沖洗3遍，拍照觀察。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SREBP-1c表達(dá)譜

從圖1 可以看出，隨著育肥進(jìn)展SREBP-1c在背最長肌和皮下脂肪組織中的表達(dá)量都顯著升高。在背最長肌中，SREBP-1c表達(dá)量在育肥前、育肥中和育肥后3 個(gè)階段表達(dá)量差異極顯著（P<0.01）；而在皮下脂肪中，SREBP-1c表達(dá)量在這3個(gè)階段差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

圖1 SREBP-1c在淮南豬不同育肥時(shí)期背最長?。ˋ）和皮下脂肪（B）中的表達(dá)量Fig.1 The expression of SREBP-1c in longissimus dorsi（LD）muscle（A）and subcutaneous fat（B）at different fattening periods of Huainan pigs

2.2 SREBP-1c干擾效率分析

在豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染SREBP-1c不同siRNA，每種siRNA均包含50 nmol/L和75 nmol/L 2種濃度。轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞，提取RNA 后進(jìn)行RTqPCR 檢測，結(jié)果如圖2 所示。與Ctrl siRNA 相比，SREBP-1csiRNA1和SREBP-1csiRNA2對SREBP-1c表達(dá)量的干擾效果不顯著，而不同濃度的SREBP-1csiRNA3 對SREBP-1c表達(dá)量的影響均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。其中在75 nmol/L 時(shí)SREBP-1csiRNA3 對SREBP-1c的干擾效率更強(qiáng)，用于后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

圖2 不同siRNA在50 nmol/L（A）和70 nmol/L（B）時(shí)對SREBP-1c的干擾效率Fig 2 Interference efficiency of different siRNAs at 50 nmol/L（A）and 70 nmol/L（B）on expression of SREBP-1c

2.3 SREBP-1c干擾對脂質(zhì)沉積的影響

為了研究SREBP-1c對豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響，在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SREBP-1csiRNA3（75 nmol/L），轉(zhuǎn)染24 h 收集細(xì)胞，通過RTqPCR 檢測SREBP-1c互作基因和脂質(zhì)沉積關(guān)鍵基因表達(dá)量變化，同時(shí)誘導(dǎo)分化至第8 天進(jìn)行油紅O染色。從圖3可以看出，與對照組相比，促進(jìn)脂質(zhì)沉積 的 關(guān) 鍵 基 因PPARγ、C/EBPα、FAS、FABP4和CIDEC的表達(dá)量在SREBP-1c干擾組均極顯著降低（P<0.01）。

圖3 SREBP-1c干擾對脂質(zhì)沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SREBP-1c interference on expression of adipogenesis related genes

油紅O 染色結(jié)果（圖4）顯示，與對照組相比，SREBP-1c干擾處理后，誘導(dǎo)分化后肌內(nèi)脂肪細(xì)胞染料著色點(diǎn)少，說明脂質(zhì)沉積減少。

圖4 SREBP-1c干擾對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響Fig.4 The influence of SREBP-1c interference on lipid deposition in intramuscular adipocytes

3 結(jié)論與討論

肌內(nèi)脂肪含量對豬肉品質(zhì)有重要影響，在一定范圍內(nèi)提高肌內(nèi)脂肪含量有助于改善肉的嫩度和風(fēng)味等感官品質(zhì)[4]。肌內(nèi)脂肪是肌肉組織脂肪的主要儲存庫，肌內(nèi)脂肪沉積受多種調(diào)控因子的協(xié)同調(diào)控[31?33]。PPARγ 是脂肪生成和脂肪組織發(fā)育的核心因子，主要表達(dá)于背最長肌的脂肪組織中調(diào)節(jié)脂肪生成，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)[34?35]。心肌脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因主要在背最長肌表達(dá)[36]，隨著背最長肌的成熟其表達(dá)量逐漸上調(diào)，影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，是肌內(nèi)脂肪含量的強(qiáng)遺傳標(biāo)記[37?38]。

SREBP-1c 是脂肪細(xì)胞分化過程中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化和脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖代謝相關(guān)的酶基因的表達(dá)。SREBP-1c也參與調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積，但關(guān)于SREBP-1c在脂肪代謝和肌內(nèi)脂肪沉積中的作用，不同研究的結(jié)果仍有矛盾。ZHAO 等[39]在烏金豬的研究中發(fā)現(xiàn)，SREBP-1c促進(jìn)脂肪生成，抑制脂肪分解，提高肌內(nèi)脂肪含量。CHEN 等[40]在二花臉豬研究中，SREBP-1c的mRNA 表達(dá)量和豬背最長肌肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，但STACHOWIAK 等[41]的研究結(jié)果表明，SREBP-1c表達(dá)量與背最長肌的肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成之間沒有相關(guān)性。為明確SREBP-1c對肌內(nèi)脂肪沉積的影響，本研究首先通過RT-qPCR技術(shù)檢測SREBP-1cmRNA 在淮南豬育肥過程中表達(dá)變化情況，結(jié)果提示，隨著育肥進(jìn)展，SREBP-1c在背最長肌和皮下脂肪的表達(dá)量均顯著升高，其中在背最長肌不同育肥階段表達(dá)差異達(dá)極顯著水平，而在皮下脂肪不同階段表達(dá)差異達(dá)顯著水平。提示SREBP-1c可能對背最長肌脂質(zhì)沉積的調(diào)控作用更強(qiáng)，與李長龍等[42]的研究結(jié)果一致，其對梅山豬、蘇太豬和杜×長×大不同豬種關(guān)聯(lián)分析表明，SREBP-1c基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)，但與背膘厚的相關(guān)性沒有達(dá)到顯著水平。在豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，進(jìn)一步利用干擾技術(shù)分析SREBP-1c對脂質(zhì)沉積的影響，發(fā)現(xiàn)SREBP-1c直接互作的PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)量均顯著降低，與肌內(nèi)脂質(zhì)沉積相關(guān)的基因FAS、FABP4和CIDEC也顯著下調(diào)。前人研究表明SREBP-1c可增強(qiáng)PPARγ活性，PETTINELLI 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者肝臟中SREBP-1c誘導(dǎo)PPARγ表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)脂質(zhì)沉積。在C57BL/6 小鼠模型上，AMPK/Sirt 1/SREBP-1c/PPARγ 通路可減輕高脂高糖飲食誘導(dǎo)的脂肪肝[44]。SREBP-1c促進(jìn)脂質(zhì)沉積的作用可能與其直接與PPARγ啟動子區(qū)反應(yīng)元件相互作用，激活PPARγ的表達(dá)有關(guān)[45]。本研究中，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞SREBP-1c表達(dá)量被抑制，PPARγ表達(dá)量也隨之降低，提示在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，SREBP-1c對PPARγ可能也有類似的調(diào)控作用。在成熟脂肪細(xì)胞終末分化過程中，PPARγ和C/EBPα相關(guān)基因之間存在正反饋回路相互調(diào)節(jié)，同時(shí)PPARγ和C/EBPα對脂聯(lián)素、FAPB4和激素敏感酯酶等靶基因的持續(xù)表達(dá)也是必不可少的[46]。本研究中，SREBP-1c表達(dá)量被抑制，PPARγ表達(dá)量降低，由于正反饋回路影響，C/EBPα表達(dá)量也隨之降低，進(jìn)而FABP4表達(dá)量也顯著降低。同時(shí)SREBP-1c也是FAS的主要調(diào)節(jié)因子，薯蕷皂甙元（DSG）可抑制SREBP-1c/FAS 途徑增加脂肪酸β 氧化，降低脂質(zhì)合成，減少細(xì)胞脂質(zhì)積累[47]。miR-23a/b-3p 與SREBP-1c和FASmRNA 的5′-UTR 結(jié)合，增強(qiáng)了二者mRNA 的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)了肝細(xì)胞甘油三酯的積累[48]。這與本研究結(jié)果一致，SREBP-1c表達(dá)量降低，F(xiàn)AS表達(dá)量也顯著降低。高通量測序?qū)Ρ炔煌?nèi)脂肪含量豬種背最長肌轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)PPARγ、CIDEC、FABP4等均與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)[49?51]。結(jié)合本研究結(jié)果說明，在豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)量降低，與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的幾個(gè)基因表達(dá)量均顯著降低，提示SREBP-1c具有促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。

本研究通過RT-qPCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著育肥進(jìn)展SREBP-1c在背最長肌和皮下脂肪表達(dá)量持續(xù)升高，不同育肥階段之間相比，SREBP-1c在背最長肌和皮下脂肪組織的表達(dá)差異達(dá)到極顯著和顯著水平。在豬原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，干擾SREBP-1c表達(dá)可抑制脂質(zhì)沉積相關(guān)基因表達(dá)，抑制脂質(zhì)沉積，提示SREBP-1c具有促進(jìn)豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。以上研究結(jié)果為豬肉質(zhì)性狀的分子選育研究提供了依據(jù)。