混菌固態(tài)發(fā)酵低次煙葉工藝優(yōu)化及揮發(fā)性致香成分分析

李 萌，王旭東，羅昭標(biāo)，宋嘉寶，曲 鵬，候?qū)帉帲智?，?智，馬 林

（1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 江西省煙草公司撫州市公司，江西 撫州 344000；3. 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 新型煙草制品中心，四川 成都 610021；4. 四川三聯(lián)新材料有限公司新型煙草事業(yè)部，四川 成都 610100；5.紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 昆明 650231）

煙草發(fā)酵是卷煙加工過程中重要的環(huán)節(jié)，微生物在發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用。發(fā)酵后煙葉刺激性減小，煙草特征香氣顯露，吸食品質(zhì)改善。煙葉發(fā)酵的方法一般分為人工發(fā)酵和自然發(fā)酵[1]，自然發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、成本高，人工添加有益微生物在煙葉發(fā)酵中能夠縮短發(fā)酵和醇化時(shí)間、降低煙堿含量和增加香氣含量，改善煙葉品質(zhì)[2]。早在20世紀(jì)中期，IZQUIERDO[3]利用微球菌屬（Micrococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株或者兩者混菌發(fā)酵煙葉，煙葉抽吸品質(zhì)得到改善。ENGLISH 等[4]利用從煙葉上分離出的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和嗜熱芽孢桿菌（Thermophilic bacillus）發(fā)酵煙葉，經(jīng)混菌發(fā)酵的煙葉產(chǎn)生悅?cè)说姆枷恪＠梦⑸镎T導(dǎo)煙葉產(chǎn)生香氣物質(zhì)的研究在國(guó)內(nèi)開展較晚，羅家基等[5]將從煙葉中篩選出的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌隨機(jī)混合發(fā)酵，經(jīng)評(píng)吸發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵煙葉比未施加菌液的發(fā)酵煙葉具有更加明顯的煙香；趙銘欽等[6]利用2 種增香菌和3 種微生物酶配制而成的煙草發(fā)酵增質(zhì)劑對(duì)在線配方煙葉進(jìn)行了處理，經(jīng)評(píng)吸表明微生物發(fā)酵增質(zhì)劑對(duì)提高卷煙整體香吃味質(zhì)量作用明顯；鄭澤浩[7]利用多個(gè)高產(chǎn)水解酶的菌株配伍制備復(fù)合菌劑，噴灑于煙葉表面發(fā)酵，能顯著改善煙葉品質(zhì)；王穎等[8]研究單一菌株和復(fù)配菌株對(duì)卷煙葉組化學(xué)成分的影響，煙葉吸食品質(zhì)明顯改善；帥瑤等[9]使用解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliticus）對(duì)煙葉進(jìn)行混菌發(fā)酵，能縮短發(fā)酵時(shí)間，提高蛋白酶活力和煙葉感官質(zhì)量；龍章德等[10]采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Oligotrophic maltophilia）混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)混合微生物發(fā)酵后煙葉香氣質(zhì)、香氣量均有所增加，煙葉刺激性和雜氣均降低。目前，關(guān)于混合微生物發(fā)酵煙葉的研究中菌株多為細(xì)菌且未對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用酵母發(fā)酵煙葉研究較少。酵母是一類重要的產(chǎn)香微生物，可利用多種基質(zhì)產(chǎn)生香氣物質(zhì)，具有安全性好、生長(zhǎng)速度快等諸多優(yōu)點(diǎn)。低次煙葉香氣量不足、雜氣重、刺激性強(qiáng)，難以在配方中應(yīng)用或僅能用于低檔卷煙，通常只能通過加香處理補(bǔ)充其香氣。郭林青等[11]將從水果中篩選的產(chǎn)香酵母（有孢漢遜酵母屬，Hansenia）接種到煙葉上進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)對(duì)煙末發(fā)酵能產(chǎn)生香味物質(zhì)。鑒于此，將前期篩選到的2 株產(chǎn)香酵母混合接種于低次煙葉中進(jìn)行發(fā)酵，探究混菌發(fā)酵對(duì)煙葉致香成分的影響，以彌補(bǔ)低次煙葉香味不足的缺點(diǎn)，旨在為應(yīng)用多菌株混合發(fā)酵改善低次煙葉品質(zhì)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品與菌株 低次煙葉來源于河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心（2016 年度平頂山DBF31 復(fù)烤煙葉）。產(chǎn)香酵母菌株為鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離篩選的優(yōu)質(zhì)酵母菌株：YJX（有孢漢遜酵母屬）和MG（畢赤酵母屬，Pichia）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸膏1%。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 主要試劑：葡萄糖（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、蛋白胨（AR，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、無水硫酸鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、二氯甲烷（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、氯化鈉（AR，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）。

主要儀器設(shè)備：煙草固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙（鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自主研制）、落地恒溫振蕩器HZQ-211C（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋HWS-12（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LXC35L（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）、無菌操作臺(tái)SW-CJ-2D（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、低溫冷卻液循環(huán)泵DLSB-5/20（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、SHSL型調(diào)溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)香酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將產(chǎn)香酵母接種到種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min 條件下活化培養(yǎng)24 h，在無菌條件下，將活化后的種子液接種至新的種子培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對(duì)照。每隔一段時(shí)間取樣，采用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)其OD600，以反映菌體生長(zhǎng)量。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 最佳發(fā)酵溫度的確定 取1 000 g 低次煙葉放入固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙，在發(fā)酵濕度70%、混菌比（YJX∶MG，下同）1∶1、接種量20%的條件下，分別在24、27、30、33、36 ℃下發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定煙葉揮發(fā)性致香成分含量。

1.2.2.2 最佳混菌比的確定 取1 000 g 低次煙葉放入固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙，在發(fā)酵濕度70%、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量20%的條件下，分別以混菌比1∶0、1∶2、1∶1、2∶1、0∶1 條件下發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定煙葉揮發(fā)性致香成分含量。

1.2.2.3 最佳接種量的確定 取1 000 g 低次煙葉放入固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙，在發(fā)酵濕度70%、發(fā)酵溫度30 ℃、混菌比1∶1 的條件下，分別取10%、15%、20%、25%、30%的菌懸液噴灑在低次煙葉上發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定煙葉揮發(fā)性致香成分含量。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（T）、混菌比（H）、接種量（J）3個(gè)因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，以煙葉致香成分含量為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Orthogonal test factors and levels

1.2.4 煙葉揮發(fā)性致香成分分析 采用同時(shí)蒸餾萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）聯(lián)用測(cè)定發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分。將發(fā)酵后的煙葉在40 ℃烘箱中干燥，用粉碎機(jī)粉碎后過孔徑為0.425 mm篩，準(zhǔn)確稱取25 g 煙末樣品、30 g 氯化鈉和200 mL水放入同時(shí)蒸餾萃取裝置一端的圓底燒瓶中，裝置的另一端盛有60 mL 二氯甲烷，在60 ℃下水浴加熱，同時(shí)蒸餾萃取2.5 h。同時(shí)蒸餾萃取完成后，二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉干燥，4 ℃下靜置過夜，過濾，加入1 mL的內(nèi)標(biāo)物后濃縮，萃取液濃縮不足1 mL 時(shí)，濃縮結(jié)束，用二氯甲烷定容至1 mL，過0.22 μm 濾膜于2.0 mL 的色譜瓶中，立即進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 GC/MS 檢測(cè)條件 色譜柱HP-5MS（60 m ×0.25 mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣；柱溫箱為程序升溫，起始溫度50 ℃保持1 min，以4 ℃/min 升至148 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至172 ℃保持1 min，以4 ℃/min 升至280 ℃保持5 min；分流比5∶1；流速3.0 mL/min。離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；EI 離子源70 eV；質(zhì)量掃描范圍35～550 amu；采用NIST14檢索。

1.2.6 感官評(píng)吸 將最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵24 h 的煙葉切絲后進(jìn)行卷制，置于溫度（22±1）℃、相對(duì)濕度（60±2）%的恒溫恒濕箱中平衡48 h。由7 人組成的專業(yè)評(píng)吸小組根據(jù)YC/T 138—1998[12]中的方法進(jìn)行評(píng)吸，對(duì)抽吸結(jié)果進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010、Origin 2018 和SPSS 22.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌YJX和MG生長(zhǎng)曲線

YJX 和MG 的 生 長(zhǎng) 對(duì) 數(shù) 期 為8～18 h、6～20 h（圖1）。因此，取13 h 作為YJX 和MG 的最佳活化時(shí)間。

圖1 酵母菌YJX和MG生長(zhǎng)曲線Fig.1 YJX yeast and MG yeast growth curve

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)煙葉致香成分總量的影響 由圖2 可知，在24～36 ℃，煙葉致香成分含量隨溫度的升高先增加后減少。當(dāng)發(fā)酵溫度在30 ℃時(shí)，煙葉中的致香成分總含量最高；之后溫度升高，煙葉中的致香成分總量減少。綜合考慮，選用27、30、33 ℃進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)煙葉致香成分總量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the total amount of aroma components in tobacco leaves

2.2.2 混菌比對(duì)煙葉致香成分總量的影響 單菌株發(fā)酵的煙葉致香成分總量普遍低于混菌發(fā)酵的煙葉致香成分總量。由圖3 可知，在混菌比為1∶1時(shí)，煙葉致香成分含量最高；在混菌比為1∶2 和2∶1條件下，煙葉致香成分總量均有所下降。綜合考慮，選擇混菌比1∶2、1∶1和2∶1進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 混菌比對(duì)煙葉致香成分總量的影響Fig.3 Effect of mixed bacteria ratio on the tobal amount of aroma components in tobacco leaves

2.2.3 接種量對(duì)煙葉致香成分總量的影響 由圖4可知，隨著微生物接種量的增加，煙葉致香成分總量呈現(xiàn)出先增大后減少的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為25%時(shí)，煙葉致香成分總量最高；當(dāng)接種量為20%和30%時(shí)，煙葉致香成分總量下降。綜合考慮，選擇15%、20%和25%進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 接種量對(duì)煙葉致香成分總量的影響Fig.4 Effect of inoculation volume on the tobal amount aroma components in tobacco leaves

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，影響發(fā)酵煙葉致香成分總量的各因素主次順序?yàn)榛炀?接種量>發(fā)酵溫度，說明混菌比的作用最大。最佳發(fā)酵條件為H3J3T2，即混菌比為2∶1、接種量為25%、發(fā)酵溫度30 ℃時(shí)，增香效果最好。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental results

2.4 單菌和混菌發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分分析

通過同時(shí)蒸餾萃取和GC/MS 分別對(duì)未發(fā)酵煙葉、單菌和混菌發(fā)酵煙葉樣品揮發(fā)性致香成分進(jìn)行測(cè)定。采用NIST14譜庫檢索定性和內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果如表3 所示，共檢測(cè)到揮發(fā)性致香成分95 種，包含12種醇類、21種羰基類、8種酸類、15種酯類和內(nèi)酯類、23種烴類、10種雜環(huán)類和6種酚類化合物。

表3 不同處理發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分GC/MS分析結(jié)果Tab.3 GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

續(xù)表3 不同處理發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分GC/MS分析結(jié)果Tab.3（Continued） GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

續(xù)表3 不同處理發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分GC/MS分析結(jié)果Tab.3（Continued） GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

不同處理下發(fā)酵煙葉的揮發(fā)性致香成分含量有明顯差異,在醇類化合物中，苯甲醇、苯乙醇和芳樟醇等重要香味物質(zhì)含量都有提高，其中苯甲醇和苯乙醇是芳香族氨基酸裂解產(chǎn)物，可增加煙葉的花香香味[13]，芳樟醇是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，也屬于萜類化合物，能夠?yàn)闊煵菰黾尤岷偷拿倒逑阄?。羰基類化合物中大多是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，由于其化學(xué)物質(zhì)閾值相對(duì)較低，對(duì)煙葉香氣質(zhì)量起主要作用[14]。與未添加微生物發(fā)酵的樣品相比，混菌發(fā)酵煙葉樣品中大馬酮和β-紫羅蘭酮含量分別提升61.14%和100.25%，且檢測(cè)出4-羥基-β-二氫大馬酮、螺巖蘭草酮、法尼基丙酮、α-大馬酮等重要香味物質(zhì)，增加了煙草中的清香、玫瑰香等[15]。在酸類化合物中，棕櫚酸香氣物質(zhì)含量較未添加微生物發(fā)酵提升79.86%，能夠增加豐滿度，間接影響煙氣的香味。在酯類和內(nèi)脂類化合物中，二氫獼猴桃內(nèi)脂是重要的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，混菌發(fā)酵煙葉中二氫獼猴桃內(nèi)酯含量較未添加微生物發(fā)酵提高147.67%，對(duì)消除煙氣刺激性具有重要作用，亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯較未添加微生物發(fā)酵分別提升42.76%和57.10%，這2 種物質(zhì)對(duì)于增加煙氣的醇和和濃度具有明顯的效果。

總體來說，混菌發(fā)酵煙葉中的揮發(fā)性致香成分含量明顯高于單菌發(fā)酵和未添加微生物發(fā)酵煙葉，混菌發(fā)酵的揮發(fā)性致香成分含量較YJX 發(fā)酵提高22.9%，較MG 發(fā)酵提高16.4%；混菌發(fā)酵煙葉中的醇類、羰基類和酸類相對(duì)含量明顯增加，酯類和內(nèi)酯類相對(duì)含量無明顯變化（圖5）。

圖5 揮發(fā)性致香成分不同類別含量分布Fig.5 Content distribution of different categories of volatile aroma components

2.5 煙葉發(fā)酵感官評(píng)吸結(jié)果

不同處理方式煙葉感官評(píng)吸結(jié)果（圖6）顯示，混菌發(fā)酵和單菌發(fā)酵煙葉均好于未添加微生物發(fā)酵煙葉，混菌發(fā)酵煙葉感官評(píng)吸結(jié)果最好。YJX∶MG=2∶1 發(fā)酵后的卷煙香氣質(zhì)、香氣量、濃度、余味改善較為明顯。

圖6 不同處理方式卷煙評(píng)吸結(jié)果Fig.6 The evaluatuin results of cigarettes by different treatment methods

3 結(jié)論與討論

本研究以低次煙葉作為發(fā)酵底物探究混菌發(fā)酵對(duì)煙葉品質(zhì)的影響，主要考察了發(fā)酵溫度、混菌比和接種量對(duì)煙葉香味成分的影響。通過正交優(yōu)化試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃、混菌比2∶1、接種量25%、發(fā)酵時(shí)間24 h，發(fā)酵過程中致香物質(zhì)含量影響因素的主次為混菌比>接種量>發(fā)酵溫度。隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵煙葉致香成分總量先增加后減少，可能是由于溫度過高微生物代謝受到抑制導(dǎo)致[16]。混菌比是影響煙葉致香物質(zhì)含量最主要的因素，隨著混菌比的變化，煙葉中致香成分總量差異明顯，這可能是由混合菌株的協(xié)調(diào)性決定的，在發(fā)酵體系中不同菌株的接種比例直接與這個(gè)體系中每一種微生物的生長(zhǎng)密度和速度有關(guān)，影響混合發(fā)酵產(chǎn)物的組成，只有混合比例合適才能更大地發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)[17]。

煙葉的香氣是評(píng)定煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)[18]。與優(yōu)質(zhì)煙葉相比，低次煙葉最大的缺陷是香氣量不足。煙葉香氣物質(zhì)按致香官能團(tuán)進(jìn)行分類可分為醇類、酮類、醛類、酯類、酸類、雜環(huán)類和烴類等[19]，其中醇類、酮類、醛類和酯類對(duì)煙葉香氣起主導(dǎo)作用，其含量可用來衡量香氣的強(qiáng)弱[20]。本研究利用混菌發(fā)酵煙葉致香成分含量明顯高于單菌發(fā)酵，揮發(fā)性致香成分含量顯著提升。就具體致香成分而言，苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、葉綠醇、大馬酮、β-紫羅蘭酮、棕櫚酸、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯等重要香氣物質(zhì)含量增加，這可能是由于酵母菌代謝主要促進(jìn)類胡蘿卜素降解、芳香族氨基酸代謝；金合歡醇、α-大馬酮、2，4-二甲基苯甲醛等重要香氣物質(zhì)只有在混菌發(fā)酵煙葉中檢測(cè)到，這可能是由于混菌發(fā)酵能夠獲得某些單一微生物發(fā)酵無法得到的產(chǎn)物[21]。感官評(píng)吸結(jié)果表明，混菌發(fā)酵豐富了煙葉的花香和果香味等，這與增加的香味物質(zhì)多為花香和果香物質(zhì)一致，發(fā)酵后煙葉香氣充足，刺激性減小，感官質(zhì)量明顯提高。

本研究通過正交試驗(yàn)優(yōu)化混菌發(fā)酵煙葉條件，利用GC/MS 對(duì)不同處理發(fā)酵煙葉中的揮發(fā)性致香成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵能夠明顯增加低次煙葉醇類和羰基類等重要香氣物質(zhì)含量，發(fā)酵后低次煙葉感官品質(zhì)顯著提升。本研究采用混菌發(fā)酵改善低次煙葉品質(zhì)，但其發(fā)酵機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，發(fā)酵條件也有待進(jìn)一步深入優(yōu)化，為應(yīng)用到工業(yè)發(fā)酵中提供參考。