8 種觀賞草對銅鋅復(fù)合脅迫的生理響應(yīng)及耐受性評價

許志敏，周 英，楊鵬輝，熊志秦，吳一非，姜珺珺，丁國昌

（1. 江西科技學(xué)院 藝術(shù)設(shè)計學(xué)院，江西 南昌 360100；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 園林學(xué)院，福建 福州 350002；3. 九江市野生動植物保護中心，江西 九江 332000）

隨著城鎮(zhèn)化和工業(yè)化的快速發(fā)展，以及人類日?；顒訌姸鹊募哟螅罅恐亟饘傥廴疚锱欧湃胱匀幌到y(tǒng)，進而降低自然資源質(zhì)量，危害所有形式的活生物體正常生長生存[1?2]。土壤是重要的物質(zhì)和能量交換媒介，亦是陸生植物生長繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，人為的干擾是導(dǎo)致土壤污染加劇的主要原因[3]。全球年均釋放到環(huán)境中的鋅為23.6萬t，銅為14.7萬t，而我國土壤中的銅、鋅污染亦占較大比例[4]，因此治理土壤重金屬污染已成全球性難題。同時，土壤重金屬污染大多數(shù)是2 種或2 種以上重金屬共同作用而形成的復(fù)合污染[5]，拮抗、協(xié)同和加和作用加大了對土壤重金屬污染的治理難度。相較于其他土壤治理技術(shù)，植物修復(fù)技術(shù)具有操作簡便、凈化率高、成本低且可大面積推廣應(yīng)用等特性[6]，而開展高效修復(fù)能力的植物種類或個體篩選及機制研究是建立植物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。

觀賞草作為一類株型優(yōu)美、色彩豐富、種類多樣的新型園林綠化植材[8]，具有較高的觀賞及生態(tài)價值，被廣泛應(yīng)用于城市公園、專題園、生態(tài)園區(qū)等各類園林綠地。目前，觀賞草的研究主要集中于種質(zhì) 資 源 搜 集[9?10]、生 理 生 化[11?12]及 園 林 應(yīng) 用[13?14]等 領(lǐng)域，而觀賞草具備生物量大、根系龐大、生長迅速、抗逆性強等特性，符合超富集植物或耐性植物的篩選條件，作為潛在植物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用植材的研究報道較少。鑒于此，在孟曉蕊[15]、何新杰等[16]研究的基礎(chǔ)上，初步篩選8種觀賞草作為供試材料，設(shè)置不同梯度的銅鋅復(fù)合脅迫試驗，從生長指標及抗氧化酶方面探究其生長及生理響應(yīng)，然后利用Pearson相關(guān)性分析和隸屬函數(shù)法進行耐受性綜合評析，旨在揭示8種觀賞草對銅鋅脅迫環(huán)境的耐受性、適應(yīng)性，以期為銅鋅超富集植物的種質(zhì)資源篩選及觀賞草耐重金屬機制研究提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為1 年生小兔子狼尾草、金紅羽狼尾草、紫葉狼尾草、細葉芒、麗色畫眉草、細葉畫眉草、香茅、粉黛亂子草，采購于福州樂彩園藝責任有限公司。選擇個體、分蘗和健康狀況基本一致的1 年生實生苗，在福建農(nóng)林大學(xué)中華植物園大棚中進行試驗。

1.2 試驗方法

土壤銅、鋅復(fù)合脅迫處理設(shè)置5個濃度梯度，梯度值如表1 所示，每個處理重復(fù)3 次。選用福州本地的紅壤土作為盆栽基質(zhì)，土壤風(fēng)干過篩，銅以CuSO4·5H2O、鋅以ZnSO4·7H2O 水溶液的形式加入土壤中并混合均勻，在室溫下靜置30 d后裝盆，每盆[28 cm（徑）×35 cm（高）]裝土4 kg（干質(zhì)量），盆下墊托盤。盆栽土銅、鋅質(zhì)量濃度分別為11.37、68.63 mg/L。2019 年4 月初進行植株移栽換盆，并將植株修剪至同一高度，4 月中旬對供試材料進行土壤銅鋅復(fù)合污染處理。自處理后，根據(jù)每盆土壤水分狀況，每隔1～3 d 等量澆入自然水一次，使土壤的田間持水量保持在80%左右。為了避免重金屬的流失，每次加完水后清洗托盤，再將水倒入盆中。

表1 盆栽試驗銅鋅復(fù)合脅迫處理梯度值Tab.1 Copper-zinc combined stress gradient values in pot test mg/L

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長狀況測定

1.3.1.1 生長狀態(tài)觀察 在銅鋅復(fù)合脅迫90 d（2019 年7 月中旬），對植株銅鋅復(fù)合脅迫傷害癥狀采用分級調(diào)查法[17]進行調(diào)查，將植株脅迫傷害癥狀分為5 級。0 級：正常生長，表現(xiàn)特征看不到傷害癥狀；1級：葉色微黃，輕度傷害；2級：中心部位及外圍不同程度失綠；3 級：植株矮小、萎蔫，葉片失綠；4級：葉片萎蔫失綠，嚴重時脫落，死亡。

1.3.1.2 株高和根長測定 在銅鋅復(fù)合脅迫90 d（2019 年7 月中旬），測定植株株高、根長。用鋼卷尺自植株的地徑至最長葉尖測量株高，用直尺自根部至根尖測定根長。

1.3.2 生理活性指標測定 在銅鋅復(fù)合脅迫90 d（2019 年7 月中旬），參考王學(xué)奎[17]的方法測定植株葉片中丙二醛（MDA）含量、過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性4項指標。使用多功能酶標儀測定各指標的吸光度值。

1.3.3 耐銅鋅脅迫能力評價 采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值的方法進行抗逆性綜合評定[18]。隸屬函數(shù)值的換算方法：

式中，R(Xij)表示i處理j指標的耐銅鋅隸屬函數(shù)值，Xij表示i處理j指標的測定值，Xjmax和Xjmin分別表示各處理的最大和最小測定值，R(Xi)為i處理的耐銅鋅隸屬函數(shù)值的平均值，n為指標數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析均基于Excel 2010和SPSS 23.0 軟件進行，采用Excel 2010 軟件作圖。運用One-Way ANOVA 進行方差分析，有顯著或極顯著差異時用DUNCAN’S法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草生長狀態(tài)的影響

如表2 所示，隨著脅迫濃度的升高，8 種觀賞草受脅迫傷害程度加劇。在T1 時，金紅羽狼尾草、紫葉狼尾草和細葉畫眉草脅迫傷害等級為0 級，生長勢正常；其余5 種觀賞草的脅迫傷害等級為1～2 級，出現(xiàn)不同程度的葉色發(fā)黃、失綠、葉緣卷邊的癥狀，均屬于輕度損傷。在T2 時，除細葉畫眉草外，其余7 種觀賞草均受到不同程度的脅迫傷害，其中細葉芒、麗色畫眉草和粉黛亂子草的脅迫傷害等級達到3級，供試植株矮小、萎蔫，葉片失綠，均屬于中重度損傷。在T3—T4 時，除細葉畫眉草外，其余7 種觀賞草的脅迫傷害等級最高達到4 級，供試植株的葉片萎蔫失綠，部分葉片嚴重脫落，根部出現(xiàn)腐爛癥狀，甚至死亡。

表2 銅鋅復(fù)合脅迫傷害癥狀分級調(diào)查結(jié)果Tab.2 Investigation on classification of injury symptoms under Cu2+and Zn2+combined stress 級

2.2 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草株高、根長的影響

如表3 所示，不同處理對供試觀賞草株高及根長的影響有所差異。金紅羽狼尾草和粉黛亂子草的株高隨銅、鋅質(zhì)量濃度的升高呈先增后減的趨勢，其余6種供試觀賞草的株高呈逐漸降低的趨勢。在T1時，金紅羽狼尾草和粉黛亂子草的株高較對照分別顯著高出10.40%、7.94%（P<0.05）；而小兔子狼尾草的株高下降幅度最大，僅為對照的64.81%。在T2—T4 時，8 種供試觀賞草株高的下降速率加快，T4時株高均降至最低。

表3 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草株高、根長的影響Tab.3 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on plant height and root length of tested ornamental grasses cm

金紅羽狼尾草、紫葉狼尾草和細葉畫眉草的根長呈先增后減的趨勢，其余5 種供試觀賞草的根長均呈逐漸下降的趨勢。在T1 時，金紅羽狼尾草、紫葉狼尾草和細葉畫眉草的根長分別較對照增加了5.98%、3.35%、3.38%；其他5 種供試觀賞草的根長出現(xiàn)不同程度的下降，細葉芒、香茅和粉黛亂子草根長顯著低于對照（P<0.05），表明低濃度脅迫對其根系的生長造成了明顯的抑制作用。在T2—T4時，8 種供試觀賞草的根系生長受到的抑制作用隨銅、鋅質(zhì)量濃度的升高而加劇，在T4 時根長降至最低，這種影響效應(yīng)與株高保持一致。

2.3 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草MDA含量的影響

如圖1可知，8種供試植物的MDA含量隨銅、鋅質(zhì)量濃度的升高逐漸增加并高于對照，且不同品種間存在較大差異。紫葉狼尾草的MDA 含量受脅迫影響最大，在T1 時，其MDA 含量達到1.17 μmol/g，是對照的1.61 倍；在T2—T3 處理時，MDA 含量分別是對照的2.64 倍、3.63 倍，且均與對照差異顯著（P<0.05）；T4 則均死亡，未獲取到樣本。在T1 時，金紅羽狼尾草和麗色畫眉草的MDA 含量分別為1.19、1.36μmol/g，與對照無顯著差異（P>0.05），隨著質(zhì)量濃度的持續(xù)增加，二者MDA含量分別較對照增加了1.46～2.43 倍、1.49～2.64 倍。小兔子狼尾草、細葉芒和粉黛亂子草在各個處理間變化趨勢相近，在T4時MDA 含量達到最高，三者MDA 含量分別為對照的3.08 倍、2.99 倍和3.32 倍。香茅的MDA 含量變化較小，T1—T4是對照的1.20～2.19倍。

圖1 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草MDA含量的影響Fig.1 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on MDA content of tested ornamental grasses

2.4 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草CAT活性的影響

隨脅迫濃度的升高，供試觀賞草的CAT 活性均呈先上升后下降的趨勢（圖2）。在T1 時，紫葉狼尾草、香茅和麗色畫眉草的CAT 活性與對照差異顯著（P<0.05），其余供試觀賞草的CAT 活性與對照相近（P>0.05）。在T2時，金紅羽狼尾草、紫葉狼尾草、粉黛亂子草和麗色畫眉草的CAT 活性達到最高，分別較對照增加了53.15%、47.77%、55.06%和46.16%；但隨著銅、鋅質(zhì)量濃度的持續(xù)增加，CAT 活性開始逐漸下降。在T3時，小兔子狼尾草、細葉芒、細葉畫眉草和香茅的CAT 活性達到最高，其值分別為30.62、32.60、34.70、35.90 U/g，比各自對照分別增加了66.87%、68.65%、51.73%、76.76%；但在T4處理時則出現(xiàn)明顯下降的趨勢。

圖2 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草CAT活性的影響Fig.2 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on CAT activity of tested ornamental grasses

2.5 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草SOD、POD活性的影響

隨著脅迫濃度的升高，所有供試觀賞草的SOD活性均呈先增大后減小的趨勢（圖3）。T1處理金紅羽狼尾草、細葉芒和粉黛亂子草的SOD 活性與對照無顯著差異（P>0.05），而其余供試觀賞草的SOD 活性上升幅度大且與對照差異顯著（P<0.05）。T2 處理紫葉狼尾草的SOD 活性達到最大，較對照增加了25.39%，隨后在T3 時明顯下降。除紫葉狼尾草外，供試觀賞草T3 處理SOD 活性均達到最高，在T4 時下降，但仍高于對照。金紅羽狼尾草的SOD 活性上升水平最高，在T1—T3 處理，其SOD 活性分別增加7.33%、31.95%和47.92%；其次細葉畫眉草和香茅的增加幅度亦較大；麗色畫眉草、粉黛亂子草、細葉芒和小兔子狼尾草的增加幅度較小，T3處理分別較對照增加了29.85%、28.89%、24.67%和20.89%。T4所有供試觀賞草的SOD活性均開始下降。

圖3 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草SOD活性的影響Fig.3 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on SOD activity of tested ornamental grasses

銅鋅復(fù)合脅迫下供試觀賞草的POD 活性均有所提高，細葉芒和香茅隨脅迫濃度的升高呈先增后減的趨勢，其余6 種供試觀賞草均呈逐漸上升的趨勢（圖4）。細葉畫眉草的POD 活性上升幅度最大，在T2—T4 處理時，細葉畫眉草的POD 活性顯著增加，分別較對照增加了33.59%、54.10%和68.22%。粉黛亂子草的POD活性增加幅度亦較大，T4處理較對照增加了61.27%。小兔子狼尾草和麗色畫眉草的POD 活性增加幅度相近，T1—T4 處理分別增加了12.23%～36.25%和8.86%～40.06%。金紅羽狼尾草和紫葉狼尾草的POD 活性隨質(zhì)量濃度的升高而增加，且增大的趨勢較為平緩。T3 處理細葉芒和香茅的POD 活性達到最高，分別較對照增加了40.82%和32.52%；T4 處理的POD 活性下降，但仍高于對照。

圖4 銅鋅復(fù)合脅迫對供試觀賞草POD活性的影響Fig.4 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on POD activity of tested ornamental grasses

2.6 銅、鋅質(zhì)量濃度與供試觀賞草生長、抗氧化酶活性指標之間的相關(guān)性分析

利用SPSS 進行Pearson 相關(guān)性分析以直觀體現(xiàn)各變量之間的相互關(guān)系。如表4 所示，溶液質(zhì)量濃度與供試觀賞草的生長指標呈顯著性相關(guān)，其中與脅迫傷害等級呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與株高、根長分別呈極顯著負相關(guān)（P<0.01）和顯著負相關(guān)（P<0.05）。生長指標中的脅迫傷害等級與抗氧化酶活性指標中的MDA 含量、POD 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），這與溶液質(zhì)量濃度和抗氧化酶活性的相關(guān)性結(jié)果一致；而株高與MDA 含量、POD 活性呈顯著負相關(guān)（P<0.05），但均與CAT、SOD 活性無相關(guān)性（P>0.05）。株高與根長呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），MDA 含量、CAT 活性、POD 活性、SOD 活性四者之間均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

表4 銅、鋅質(zhì)量濃度與供試觀賞草生長、抗氧化酶活性指標之間的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of concentration of Cu2+and Zn2+，growth index and antioxidant enzyme activity of tested ornamental grasses

2.7 基于隸屬函數(shù)法的8種觀賞草對銅鋅的耐受性評價

運用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法，將各個濃度處理下的脅迫傷害等級、株高、根長、MDA 含量、CAT活性、POD 活性和SOD 活性7 個指標相對值的平均值作為實測值，計算各指標的隸屬函數(shù)值和綜合評價值（表5）。8 種供試觀賞草對銅鋅復(fù)合脅迫的耐受性強弱依次為細葉畫眉草>金紅羽狼尾草>香茅>粉黛亂子草>麗色畫眉草>細葉芒>小兔子狼尾草>紫葉狼尾草。

表5 供試觀賞草各指標的隸屬函數(shù)值及綜合評價值Tab.5 Membership function value and comprehensive evaluation value of each index of tested ornamental grasses

3 結(jié)論與討論

重金屬對植物毒害作用通常表現(xiàn)為抑制植物植株的生長和促進植物的蔫萎死亡[19]。本研究表明，在不同質(zhì)量濃度的銅鋅復(fù)合脅迫處理下，8種供試觀賞草的生長狀況均受到不同程度的抑制作用。細葉畫眉草的生長狀況最佳，在T1—T2 處理，植株生長與對照無差異，而其余7 種供試觀賞草均有出現(xiàn)不同程度的毒害效應(yīng)；隨著質(zhì)量濃度的升高，細葉畫眉草仍能較為正常的生長，而另7 種供試觀賞草脅迫傷害等級達到最高，生長嚴重受限，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。供試觀賞草在株高和根長方面存在較大差異，隨著質(zhì)量濃度的升高，金紅羽狼尾草和粉黛亂子草的株高及金紅羽狼尾草、紫葉狼尾草和細葉畫眉草的根長呈先增后減的趨勢，這屬于低促高抑的現(xiàn)象，其與鄒文桐等[20]研究銅鋅復(fù)合脅迫對菜薹種子萌發(fā)、幼苗生長及子葉生理代謝的影響一致。由于重金屬銅和鋅均是植物生長必需的元素，適量的銅、鋅會加速植物體內(nèi)酶促生理反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞進行有絲分裂，促進其生長；而高濃度銅、鋅會使蛋白質(zhì)變性降解，或?qū)е碌鞍踪|(zhì)合成酶失活及DNA 轉(zhuǎn)錄翻譯途徑受阻，從而抑制植物葉片蛋白質(zhì)的合成，植物生長受阻[21]。其余供試觀賞草的株高和根長則隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸降低，究其原因可能與供試觀賞草對銅鋅元素比較敏感或設(shè)置的初始濃度較高有關(guān)。

MDA 作為膜脂過氧化的終產(chǎn)物，亦是檢驗植物受氧化脅迫程度的生理指標之一。MDA 能夠抑制植物體內(nèi)抗氧化酶活性并降低抗氧化物含量，引發(fā)膜脂受到過氧化傷害[22]。本研究表明，8 種供試觀賞草的MDA含量較對照均有顯著增加，表明銅鋅復(fù)合脅迫增加了膜脂過氧化反應(yīng)，且濃度增加，膜脂過氧化反應(yīng)加重，對植株生長產(chǎn)生脅迫。這與陳艾[23]、鄔絲[24]等研究結(jié)果一致。植物體內(nèi)存在2 種抗氧化系統(tǒng)，包括CAT、SOD、POD 在內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)以及小分子抗氧化物質(zhì)，其中抗氧化酶系統(tǒng)用來清除逆境脅迫造成的活性氧，SOD 與清除活性氧自由基，CAT、POD與清除H2O2有關(guān)[25]。在正常情況下，植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)能夠有效清除體內(nèi)的活性氧自由基，從而使細胞免受傷害。但在逆境下，植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生速度超出了植物清除活性氧的能力，從而引起傷害[26]。本研究表明，所有供試觀賞草葉片中的CAT、SOD 活性隨質(zhì)量濃度的升高呈先增后減的趨勢，這與周紅衛(wèi)[27]和張廷婷等[28]的研究結(jié)果一致。當銅鋅復(fù)合質(zhì)量濃度較低時（T1—T2），供試植物的SOD 和CAT 活性有所提升，說明防御酶系統(tǒng)能在重金屬低濃度范圍內(nèi)起保護作用[29]，但超過一定量時（T3或T4），2種酶活性開始降低，說明自由基引起的傷害累積超過了防御酶系統(tǒng)的清除能力，抑制了其活性。除細葉芒和香茅外，其余6種供試觀賞草的POD 活性均呈增加的趨勢。表明供試觀賞草為維持抗氧化酶和活性氧體系的平衡，不斷提升POD 活性且發(fā)揮了重要作用。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明，MDA 含量、CAT 活性、SOD 活性、POD 活性相互之間呈極顯著正相關(guān)，這與上述研究結(jié)果一致，四者協(xié)同作用形成一條抗氧化鏈抵御重金屬脅迫對植物造成的傷害。

單一指標并不能全面準確地反映植物對重金屬的耐受性強弱，模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)在多指標測定基礎(chǔ)上，通過模糊邏輯運算和推理，消除了個別指標帶來的片面性，又使各材料耐性差異具有可比性[30?32]。因此，本研究采用7個指標的相對值進行隸屬函數(shù)值計算和綜合評價，結(jié)果表明，8種供試觀賞草對銅鋅復(fù)合脅迫的耐受性強弱依次為細葉畫眉草>金紅羽狼尾草>香茅>粉黛亂子草>麗色畫眉草>細葉芒>小兔子狼尾草>紫葉狼尾草。