外源性重組激活基因在人類細(xì)胞中的表達(dá)研究①

曾 艷 孫洪海 王 敏 劉 旭 嚴(yán)丹丹 孫龍飛 劉志超 韋星呈（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034）

重組激活基因（recombination activating genes，RAGs）編碼重組酶RAG1和RAG2，二者通過(guò)特異性介導(dǎo)抗原受體V（D）J基因重排，在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-2］。V（D）J重排由每個(gè)編碼基因片段兩端的重組信號(hào)序列RSS介導(dǎo)，重組激活基因是該過(guò)程的主要調(diào)控基因［2-5］。RAGs的編碼產(chǎn)物RAG-1和RAG-2蛋白的復(fù)合物是最重要的重組酶之一，參與V（D）J重組的整個(gè)過(guò)程并發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。分為兩個(gè)階段：①重組激活基因RAG-1、RAG-2將DNA切割開［7］；②非同源末端連接裝置（NHEJ）將產(chǎn)生的斷裂DNA末端連接起來(lái)形成重排產(chǎn)物，見圖1。

圖1 V（D）J重組反應(yīng)步驟示意圖Fig.1 Schematic diagram of V（D）J recombination reaction steps

RAGs基因的突變、重組酶的錯(cuò)誤識(shí)別和異常表達(dá)均可引起嚴(yán)重的臨床疾?。?-9］，如：RAG-1或RAG-2發(fā)生的錯(cuò)義突變可使其編碼的重組酶活性部分喪失，V（D）J重組發(fā)生傾向性改變，導(dǎo)致早期淋巴細(xì)胞發(fā)育被阻斷而導(dǎo)致循環(huán)中T、B細(xì)胞缺失，引起一類嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency disease，SCID），臨床上統(tǒng)稱為Omenn氏綜合征（Omenn syndrome，OS）［10-13］。RAGs基因編碼的重組酶催化V（D）J基因重排時(shí)，發(fā)生的錯(cuò)誤識(shí)別可導(dǎo)致抗原受體基因和癌基因染色體易位，也是淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生的重要因素。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對(duì)遺傳性疾病分子機(jī)制研究的深入，基因治療相關(guān)研究取得了重大突破［14-15］。在臨床應(yīng)用研究中首先獲得成功的是對(duì)腺苷酸脫氨酶（adenosine deamlnase，ADA）缺陷所致SCID的治療［16］?；蛑委熞云浞€(wěn)定性、持久性、安全性及適應(yīng)性而成為極具應(yīng)用價(jià)值的治療手段。

本研究擬通過(guò)恢復(fù)RAG-1、RAG-2分子的表達(dá)來(lái)挽救功能性淋巴細(xì)胞的分化、發(fā)育，探討從基因水平上根治RAG-免疫缺陷病的技術(shù)方法，為進(jìn)一步應(yīng)用基因治療打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 Jurkat（RAG+人胸腺T細(xì)胞）、293T（人胚腎細(xì)胞）購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)）；新生牛血清（四季青，中國(guó)）；DMSO（Sigma，美國(guó)）；Total RNA提取試劑（RNAiso Reagent）、mRNA純化試劑盒、RTPCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit）、DNA片段純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶、感受態(tài)大腸桿菌（JM 109）（大連TaKaRa生物工程公司）；Plasmid Midi Kit、轉(zhuǎn)染試劑盒（SuperFect Transfect Reagent）（Qiagen，德國(guó)）。

1.1.3 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI Prism 7300，美國(guó)）；紫外分光光度儀（Spectrometer Lambda 2S，PERKIN ELMER）；熒光和發(fā)光檢測(cè)儀（Turner Biosystems 20/20nLuminometer，美國(guó)）；超速離心機(jī)（日立CP100WX，日本）；微量高速冷凍離心機(jī)（Biofuge 28RS，德國(guó)）；PCR擴(kuò)增儀（Biometra T3thermocycle，英國(guó)）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（SHELLAB TC2323型，美國(guó)）；全溫振蕩培養(yǎng)箱（THZ-C-1，中國(guó)）；凝膠成像儀（UVP C-80，美國(guó)）；紫外交聯(lián)儀（SCIENTZ 03-Ⅱ，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 人類RAG-1、RAG-2表達(dá)載體構(gòu)建 人類RAGs表達(dá)細(xì)胞株Jurkat（1×107個(gè)/ml）在4℃下，以1 500 r/min離心5 min，棄上清。采用RNAiso Reagent提取Total RNA。

采用mRNA分離試劑盒提取mRNA，以此為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)RAG1、RAG2 cDNA。目的cDNA插入真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+），獲得攜帶RAG-1（RAG-2）編碼序列的真核表達(dá)載體phR1CS（phR2CS）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人293T細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%連片狀態(tài)時(shí)，用玻璃吸管吸棄培養(yǎng)液。加入0.25%胰酶1 ml（以浸沒細(xì)胞表面為宜）消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按5×105個(gè)/ml分瓶傳代，以10 ml含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

1.2.3 真核表達(dá)載體導(dǎo)入人類293T細(xì)胞 接種1×105個(gè)/ml細(xì)胞孵育24 h，更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。采用SuperFect Transfect Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒將phRAG1 DNA 15μg、DMEM培養(yǎng)基200μl、Super-Fect Transfect Reagent 25μl混合均勻。室溫作用20 min后，加入10 ml DMEM完全培養(yǎng)基，立即混勻，加入上述培養(yǎng)細(xì)胞。置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育40 h，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞體。

1.2.4 RAG-1、RAG-2 mRNA表達(dá)分析 將0.25%胰酶1 ml加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞（以浸沒細(xì)胞表面為宜），37℃孵育，顯微鏡下觀察細(xì)胞間連接消失（1～2 min），加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 ml中和胰酶，用吸管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)次，使其分散后，轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清以除去胰酶。以RNAiso Reagent提取Total RNA，分別以hR1CS5-S和hR1CS5-A為正、反向引物，通過(guò)RTPCR檢測(cè)RAG-1 mRNA表達(dá)產(chǎn)物；分別以hR2CS5-S和hR2CS5-A為正、反向引物，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)RAG-2 mRNA表達(dá)產(chǎn)物。以看家基因GAPDH作為內(nèi)參照。RAG-1、RAG-2 mRNA引物序列見表1。

表1 RAG-1、RAG-2 mRNA表達(dá)分析所用引物序列及產(chǎn)物Tab.1 Sequences and products of primers for RAG-1，RAG-2 mRNA expression analysis

1.2.5 DNA測(cè)序 選擇經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切檢測(cè)后符合目的DNA條件的克隆，以LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增，Qiagen Plasmid Midi Kit精制質(zhì)粒后，以T 7 Primer、hR1CS2-S、hR1CS3-S、hR1CS4-S、pcDNA3.1 Reverse Primer為測(cè)序引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序部進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析，與GenBank中RAG-1基因（Accession number：NM000448）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全相同。

RAG-2操作同RAG-1，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-2基因（Accession number：BC022397）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全相同。DNA測(cè)序用引物序列見表2。

表2 DNA測(cè)序用引物序列Tab.2 Primer sequences for DNA sequencing

2 結(jié)果

2.1 RAG-1基因構(gòu)建

2.1.1 RAG-1基因的克隆 從表達(dá)RAG-1的人類T細(xì)胞Total RNA中擴(kuò)增的RAG-1編碼序列大小為3 219 bp（圖2）。插入pMD19-T Simple Vector后，獲得攜帶RAG-1編碼序列的載體pMD-hR1CS。

圖2 RAG-1 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 RT-PCR products of RAG-l

2.1.2 RAG-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以BamHⅠ和XbaⅠ將3 209 bp的目的基因片段從pMD-hR1CS切出后，插入真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+），獲得攜帶RAG-1編碼序列的真核表達(dá)載體phR1CS（圖3）。

圖3 RAG-1真核表達(dá)載體phR1CS結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Diagram of vector phR1CS for RAG-1 expression in eukaryotic cells

重組質(zhì)粒phR1CS經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測(cè)進(jìn)行初步鑒定，得到3 209 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預(yù)期的片段大小相符（圖4）。陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序部進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-1基因（Accession number：NM000448）完全相同（附圖1，www.immune99.com）。

圖4 重組質(zhì)粒p MD-hR1CS的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid p MD-hR1CS by restriction enzyme digestion

2.1.3 人類細(xì)胞中外源RAG-1的表達(dá) 采用重組質(zhì)粒phR1CS轉(zhuǎn)染人源細(xì)胞株293T后，收獲孵育40 h的轉(zhuǎn)染體，提取Total RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可檢測(cè)到782 bp的人類RAG-1 mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而空質(zhì)粒pcDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照未檢測(cè)到此產(chǎn)物；看家基因GAPDH的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果在上述兩組間無(wú)差異，均獲得150 bp的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（圖5）。表明外源人類RAG-1的mRNA已成功表達(dá)于293T細(xì)胞。

圖5 轉(zhuǎn)染重組RAG-1編碼序列后RT-PCR檢測(cè)RAG-1 mRNA在293T細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Expression of RAG-1 mRNA in 293T cells was detected by RT-PCR after transfection of recombinant RAG-1 coding sequence

2.2 RAG-2基因構(gòu)建

2.2.1 RAG-2基因的克隆 從表達(dá)RAG-2的人類T細(xì)胞Total RNA中擴(kuò)增的含有RAG-2編碼序列的RT-PCR產(chǎn)物為1 628 bp（圖6）。插入pMD19-TSimple Vector后，獲得攜帶RAG-2編碼序列的載體pMDhR2CS。

圖6 RAG-2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.6 RT-PCR products of RAG-2

2.2.2 RAG-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ和XbaⅠ將1 618 bp的目的基因片段從pMD-hR2CS切出后，插入真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pc-DNA3.1（+），獲得攜帶RAG-2編碼序列的真核表達(dá)載體phR2CS（圖7）。

圖7 RAG-2真核表達(dá)載體phR2CS結(jié)構(gòu)示意圖Fig.7 Diagram of vector phR2CS for RAG-2 expression in eukaryotic cells

重組質(zhì)粒phR2CS經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測(cè)進(jìn)行初步鑒定，得到1 618 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預(yù)期的片段大小相符（圖8）。陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序部進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-2基因（Accession number：BC022397）完全相同（附圖2，www.immune99.com）。

圖8 重組質(zhì)粒p MD-hR2CS的酶切鑒定Fig.8 Identification of recombinant plasmid p MD-hR2CS by restriction enzyme digestion

2.2.3 人類細(xì)胞中外源RAG2的表達(dá) 用重組質(zhì)粒phR2CS轉(zhuǎn)染人源細(xì)胞株293T后，收獲孵育40 h的轉(zhuǎn)染體，提取Total RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可檢測(cè)到378 bp的人類RAG-2mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而空質(zhì)粒pcDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照未檢測(cè)到此產(chǎn)物（圖9）?？醇一騁APDH的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果在上述兩組間無(wú)差別，均獲得150 bp的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。表明外源人類RAG-2的mRNA已成功表達(dá)于293T細(xì)胞。

圖9 轉(zhuǎn)染重組RAG-2編碼序列后RT-PCR檢測(cè)RAG-2 mRNA在293T細(xì)胞中的表達(dá)Fig.9 RT-PCR was used to detect expression of RAG-2 mRNA in 293T cells after transfection of recombinant RAG-2 coding sequence

3 討論

RAG由一對(duì)位置相鄰、方向相對(duì)排列的RAG-1和RAG-2組成。其編碼產(chǎn)物RAG-1和RAG-2蛋白分子相互協(xié)同，特異性識(shí)別與免疫球蛋白（Ig）基因和T細(xì)胞受體（TCR）基因相鄰的重組信號(hào)序列（recombination signal sequence，RSS）在所募集的其他非特異性DNA酶的共同參與下，進(jìn)行雙股DNA的切口、平端化及再連接，從而完成Ig和TCR的V（D）J基因重排。

獲得性免疫防御機(jī)制對(duì)不同抗原的特異性清除作用依賴與抗原特異性結(jié)合的多樣性的淋巴細(xì)胞組群的生成。淋巴細(xì)胞的多樣性是通過(guò)RAG對(duì)Ig基因和TCR基因的重組實(shí)現(xiàn)的。

RAG的表達(dá)是淋巴細(xì)胞及其分化發(fā)育階段特異性的。在執(zhí)行淋巴細(xì)胞生成的中樞免疫器官胸腺和骨髓中，RAG的表達(dá)最為活躍。既往研究表明，RAG表達(dá)隨著淋巴細(xì)胞的分化發(fā)育形成兩次高峰。第一次高峰出現(xiàn)在祖-T（Pro-T）和祖-B（Pro-B）淋巴細(xì)胞階段，此時(shí)淋巴細(xì)胞正值Ig重鏈和TCR鏈基因的重排。第二次高峰出現(xiàn)在前-T（Pre-T）和前-B（Pre-B）淋巴細(xì)胞階段，與Ig輕鏈和TCR鏈基因重排有關(guān)。隨著淋巴細(xì)胞分化發(fā)育結(jié)束，RAG表達(dá)終止。RAG表達(dá)的階段性消長(zhǎng)與淋巴細(xì)胞的分化發(fā)育過(guò)程密切的相關(guān)性亦表明其在功能性淋巴細(xì)胞生成中的關(guān)鍵作用。

本研究中，重組質(zhì)粒phR1CS經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測(cè)進(jìn)行初步鑒定，得到3 209 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預(yù)期的片段大小相符。對(duì)真核表達(dá)載體phR1CS進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析與GenBank中人類RAG-1基因（Accession number：NM000448）完全相同；另一方面，重組質(zhì)粒phR2CS經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測(cè)初步鑒定，得到1 618 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預(yù)期的片段大小相符。對(duì)真核表達(dá)載體phR2CS進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-2基因（Accession number：NM000536）完全相同。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法成功克隆了人類RAG-1編碼基因和人類RAG-2編碼基因，構(gòu)建出RAG-1、RAG-2真核表達(dá)載體，并在轉(zhuǎn)染的人類細(xì)胞293T中獲得外源RAG-1、RAG-2的mRNA表達(dá)。為進(jìn)一步探討有效、足量表達(dá)功能性RAGs分子的技術(shù)手段，從基因水平上根治RAGs免疫缺陷病奠定了基礎(chǔ)，其基因轉(zhuǎn)移操作不需要復(fù)雜設(shè)備和技術(shù)，便于應(yīng)用，非常適合臨床治療的迫切需要，RAG1、RAG-2蛋白的表達(dá)功能活性將于后續(xù)報(bào)告闡述。