p H值對糞便微生物移植治療潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道微環(huán)境的影響①

潘張磊 王瑞珩 劉跟莉（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是好發(fā)于結(jié)腸和直腸一種原因不明的慢性、非特異性、炎癥性疾?。?］。其發(fā)病機制未明，目前認為是由于具有遺傳易感性的個體在環(huán)境因素觸發(fā)下，腸道菌群與腸道黏膜免疫構(gòu)成的腸道微環(huán)境失調(diào)［2］。腸道菌群異常在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，腸道菌群紊亂可使腸黏膜對腸道菌群的耐受降低和腸道上皮屏障受損，從而導(dǎo)致UC相關(guān)的異常黏膜免疫反應(yīng)［3］。腸道黏膜中Treg與Th17作為功能上互相制衡的一對免疫細胞，其比例和功能的穩(wěn)定與UC病情密切相關(guān)［4］。糞便微生物移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）通過將健康供體糞便中的菌群植入患者的腸道內(nèi)以恢復(fù)腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。FMT在UC患者中進行的研究表明，F(xiàn)MT能有效緩解UC，但療效存在差異［5］。腸道內(nèi)穩(wěn)定的pH值是維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)在腸道疾病如單純細菌性腹瀉和單純輪狀病毒性腸炎中，患者糞便pH存在異常［6］。故推測FMT療法中，供體菌液pH值可影響UC的療效。本實驗通過采用不同pH值的菌液進行FMT干預(yù)UC模型小鼠，旨在探究pH值對FMT治療UC和腸道黏膜免疫的影響，為FMT治療UC的規(guī)范化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性7周齡C57BL/6小鼠100只，購買及飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SYXK（黑）2016-004。葡聚糖硫酸鈉DSS購于美國MPBiomedicals公司；尿糞隱血試劑盒購于中國南京建成生物工程研究所；Percoll購于美國GE公司；APCanti-CD4、FITCanti-IL17A、PEanti-CD25、Alexa Fluor 488 anti-Foxp3抗體購于美國BD公司。流式細胞儀為美國BD公司生產(chǎn)，型號為CantoⅡ。

1.2 方法

1.2.1 供體糞便質(zhì)量控制和菌液制備 招募6名男性健康志愿者提供糞便濾液，要求年齡20～30歲，排便規(guī)律，依從性良，符合FMT2016歐洲共識標準。6名志愿者從實驗開始前1周嚴格按照食譜要求進行飲食控制。其中隨機2名志愿者為酸性糞便供體，其飲食以糖脂類食物為主；隨機2名志愿者為堿性糞便供體，飲食以瘦肉類食物為主；其余2名志愿者為中性糞便供體，其飲食以素食為主。

灌腸前取志愿者6 h內(nèi)的新鮮糞便稱重，按照糞便質(zhì)量與生理鹽水體積比1∶2的比例將兩者充分混勻；雙層無菌紗布過濾糞便混懸液，收集濾液，離心后棄上清，加入2倍糞便體積的生理鹽水，混勻后即為500 mg/ml菌液。所得菌液pH值控制為酸性菌液：pH＜6.9；堿性菌液：pH＞7.2；中性菌液：

6.9≤pH≤7.2。

1.2.2 UC模型復(fù)制和治療 100只雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分出20只作為Control組，小鼠自由飲用純凈水；其余小鼠自由飲用2%DSS溶液進行造模。7 d后，根據(jù)造模小鼠疾病活動指數(shù)分為Model組、FMT-L組、FMT-M組和FMT-H組，每組20只。參照人體FMT標準［7］，每只小鼠每次移植的糞菌量為小鼠自身體質(zhì)量1/500進行灌腸治療，F(xiàn)MT-L組、FMT-M組和FMT-H組分別給予對應(yīng)的菌液，Control組與Model組給予等量生理鹽水灌腸，2次/d，連續(xù)7 d。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 UC疾病活動指數(shù)（disease activity index DAI）評價 疾病活動程度的評價參考人體炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）疾病活動度評估方法［8］。于治療當(dāng)天開始，根據(jù)小鼠每日血便情況和大便性狀進行評分：大便性狀正常計0分，軟但成形計1分，未成形便計2分，稀便計3分。采用鄰聯(lián)甲苯胺法檢測小鼠大便隱血情況，大隱血陰性計0分，隱血陽性計1分，便中帶血計2分，血便計3分。兩項評分相加得分評估疾病活動度。

1.2.3.2 結(jié)腸長度測量及病理學(xué)檢測 第7天，頸椎脫臼法處死小鼠，取回盲部至肛門的結(jié)腸，剔除附屬組織，于濾紙上舒展開，記錄長度。取距肛門1 cm處結(jié)腸組織進行HE染色，參照如下標準進行組織病理評分（histopathological score，HPS）：0分，黏膜層正常；1分，黏膜層輕度炎癥和水腫，基底部約1/3隱窩消失；2分，黏膜層中毒炎癥，基底部約2/3隱窩消失；3分，黏膜層中度炎癥，隱窩完全消失但上皮層完整；4分，黏膜層、黏膜下層及肌層中度炎癥，隱窩完全消失，上皮層受累。

1.2.3.3 16S測序分析結(jié)腸腸道菌群變化 小鼠處死后立即收集結(jié)腸內(nèi)容物，提取內(nèi)容物細菌的DNA，通過PCR技術(shù)，對細菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)域進行二輪擴增。同時連接上接頭及Index標簽序列以獲得MiSeq測序文庫，后將產(chǎn)物用Illumina Miseq測序平臺進行雙端測序分析。

1.2.3.4 流式細胞術(shù)檢測結(jié)腸Treg與Th17百分比 參照文獻［9］獲取腸黏膜固有層淋巴細胞。以CD4+、CD25+、Foxp3+為標記識別Treg，以CD4+、IL-17+為標記識別Th17，染色固定后，于流式細胞儀上檢測結(jié)腸黏膜固有層淋巴細胞Tregs與Th17百分比［10］。

1.2.3.5 Luminex高通量法分析結(jié)腸組織免疫因子 通過Luminex高通量法分析結(jié)腸組織中IL-10、IL-17A、TGF-β1、IL-4、IFN-γ、TNF-α等免疫因子的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0分析，表示為±s或中位數(shù)（四分位間距，IQR）。由成組t檢驗（Mann-Whitney）或單因素方差分析（ANOVA）以及最小顯著性差異（Least-significant difference，LSD）檢驗確定顯著性差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的疾病活動程度變化 如圖1所示，經(jīng)DSS誘導(dǎo)第7天，UC模型誘導(dǎo)成功。Model組評分顯著高于Control組（P＜0.01）。經(jīng)治療后，F(xiàn)MT-L、FMT-M和FMT-H組DAI評分呈不同程度的下降趨勢。治療結(jié)束時，F(xiàn)MT-L、FMT-M、FMT-H組與Model組相比DAI評分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）；且FMT-M組降低程度較FMT-L、FMT-H組明顯。

圖1 各組小鼠疾病活動程度變化Fig.1 Disease activity degree in mice

2.2 小鼠結(jié)腸的病理改變 如圖2所示，經(jīng)統(tǒng)計，UC模型處理后顯著降低小鼠結(jié)腸長度（P＜0.01），經(jīng)不同pH值FMT移植后，結(jié)腸長度較模型組有不同程度的恢復(fù)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），以FMTM組改善程度最為顯著（P＜0.01）。此外，病理HPS評分進一步證明UC造模對小鼠結(jié)腸的病理損傷和不同pH值FMT對組織損傷的改善作用。UC造模導(dǎo)致大部分小鼠結(jié)腸出現(xiàn)黏膜層、黏膜下層及肌層中度炎癥，HPS評分較正常小鼠顯著升高（P＜0.01）。經(jīng)不同pH值FMT干預(yù)治療后，結(jié)腸病理損傷得到不同程度改善（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），且與結(jié)腸長度變化趨勢類似，以FMT-M干預(yù)對結(jié)腸病理損傷的改善程度最為顯著（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠結(jié)腸長度和結(jié)腸組織病理評分情況Fig.2 Length and histopathological score of colon in mice

2.3 小鼠腸道菌群變化 16S測序結(jié)腸腸道菌群α多樣性特征結(jié)果顯示（圖3），Model組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)較Control組相比顯著下降（P均＜0.01）；經(jīng)不同pH值FMT治療后，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均回升，以FMT-M組上升程度最大（P＜0.01，P＜0.01）。基于OTU水平的NMDS分析結(jié)果，圖4。組內(nèi)樣本點分布相對集中，組間樣本點分布以Control為中心，Model組、FMT-L組、FMT-M組、FMT-H組的樣本以逆時針方向分布。即各組組內(nèi)樣本功能分類分布相似，F(xiàn)MT改變結(jié)腸腸道菌群分布，且不同pH值下菌群結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3 各組小鼠結(jié)腸腸道菌群α多樣性Fig.3 Alpha diversity of intestinal flora in colon

圖4 各組小鼠結(jié)腸菌落NMDS圖Fig.4 NMDSmap of colony in mouse colon

2.4 小鼠結(jié)腸Treg和Th17比例 流式結(jié)果顯示，Model組Treg細胞的比例較Control組顯著下調(diào)（P＜0.01），經(jīng)FMT治療后，Treg細胞比例不同程度回升（P均＜0.01），升高最顯著的為FMT-M組（P＜0.01，圖5）；Model組Th17細胞的比例較Control組顯著上升（P＜0.01），經(jīng)FMT治療后，Th17細胞比例不同程度下降（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），下降最顯著為FMT-M組（P＜0.01，圖6）。

圖5 各組小鼠結(jié)腸固有層淋巴細胞中Treg比例Fig.5 Proportion of Treg in lamina propria lymphocytes of colon

圖6 各組小鼠結(jié)腸固有層淋巴細胞中Th17細胞比例Fig.6 Proportion of Th17 cells in lamina propria lymphocytes of colon

2.5 小鼠結(jié)腸免疫因子表達水平 如圖7所示，UC造模顯著降低結(jié)腸中Treg功能相關(guān)因子IL-10和TGF-β1的表達（P＜0.05，P＜0.01）；且Th17功能相關(guān)蛋白IL-17A和炎癥因子IL-4、IFN-γ、TNF-α的表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），結(jié)腸中免疫狀態(tài)嚴重失衡，炎癥明顯。經(jīng)FMT治療后，除FMT-H組IL-4的表達和FMT-L組TNF-α的表達外，其余因子的表達水平均不同程度改善（P＜0.05或P＜0.01）。其中，均以FMT-M組的改善作用最為顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

圖7 各組小鼠結(jié)腸組織勻漿免疫相關(guān)因子表達水平Fig.7 Expression levelsof immune-related factorsin mouse colon tissue

3 討論

腸道菌群與黏膜免疫的平衡構(gòu)成腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，二者相互影響，相互依存。機體能夠承載一定范圍內(nèi)的腸道微環(huán)境內(nèi)在變化，而當(dāng)腸道黏膜存在慢性炎癥如炎癥腸病、克羅恩病和UC等疾病或潛在的基因改變則可導(dǎo)致腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、病原菌的清除、定植紊亂以及腸道菌群改變［2］。研究顯示UC患者糞便的微生物群落生物多樣性減少，通過延緩腸道菌群多樣性的喪失，可增強治療UC的療效［11］。通過移植腸球菌至遺傳易感的小鼠可促進UC發(fā)病以及通過移植雙歧桿菌至UC模型小鼠后獲得良好療效［12-13］。本實驗結(jié)果顯示UC造模后，其結(jié)腸腸道菌群多樣性降低，通過FMT治療改善了以菌群多樣性為標志的腸道菌群紊亂。

目前，由于治療難治性和復(fù)發(fā)性難辨梭狀芽胞桿菌感染的顯著療效，F(xiàn)MT已成為治療微生物群改變相關(guān)疾病的熱點。且在輕度至中度UC患者的隨機臨床試驗中，F(xiàn)MT也顯示出治療潛力。盡管如此，目前對FMT發(fā)揮治療UC的機制研究主要集中于宿主代謝調(diào)節(jié)上，對腸道免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)研究仍處于初步階段［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)，在急性實驗性腸道炎癥期間，F(xiàn)MT治療可調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性黏膜免疫反應(yīng)，從而控制腸道炎癥［16］。傳統(tǒng)的CD4+T輔助性細胞已被證明在協(xié)調(diào)腸道炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。相反，調(diào)節(jié)T細胞群如Tregs和Tr1細胞，參與了對Th17介導(dǎo)UC患者致病反應(yīng)的控制［10］。Tregs和Th17細胞的動態(tài)平衡是維持免疫穩(wěn)定的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，Tregs和Th17細胞調(diào)控關(guān)系的失衡與炎癥、腫瘤及自身免疫疾病密切相關(guān)，Tregs和Th17作為功能上相互制衡的一對免疫細胞，已發(fā)現(xiàn)在UC中存在比例失調(diào)［17］。Tregs通過分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β1等實現(xiàn)免疫抑制功能，Tregs的過度消耗會加重UC。Th17細胞作為促炎細胞，通過分泌IL-17A促進腸道炎癥，惡化UC。研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)Treg和Th17的平衡，可以改善UC的嚴重程度［4，18］，而FMT對Tregs和Th17的影響卻未見報道。本研究顯示，F(xiàn)MT能增加黏膜中Tregs的百分比和Tregs相關(guān)抗炎分子IL-10和TGF-β1的水平，同時降低黏膜中Th17的數(shù)量和Th17相關(guān)致炎分子IL-17A的水平，調(diào)節(jié)腸道免疫微環(huán)境，改善腸道炎癥，其中以中性pH值FMT治療效果最佳。

pH值通常用來檢測人體血液的酸堿平衡情況，對各種危重病的診斷及治療有著非常重要的意義，但糞便pH值的檢測臨床上應(yīng)用較少。而實際上糞便pH值是腸道微環(huán)境的重要組成部分，在生理情況下保持恒定（pH=6.9～7.2），病理情況下常出現(xiàn)酸堿平衡失調(diào)。對急性腹瀉患兒糞便pH值的研究發(fā)現(xiàn)單純細菌性腹瀉中，83.0%患兒糞便pH值偏堿性，而單純輪狀病毒性腸炎中，67.5%糞pH值偏酸性，二者糞pH值差異顯著［6］。不同菌群對環(huán)境pH的范圍有相對選擇性，菌液pH的差異實為菌群分布的差異。大部分細菌的最適pH 6.5～7.5，而大腸桿菌能夠在pH=4.5～8.0的環(huán)境下生存，且過酸會抑制雙歧桿菌的生長和繁殖［19］。故對供體菌液pH值的選擇尤為重要。本實驗結(jié)果證明，不同pH值菌液移植誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸中不同的菌落分布，顯著增加UC模型小鼠結(jié)腸菌群豐富度和多樣性，改善腸道微環(huán)境；調(diào)節(jié)UC小鼠結(jié)腸組織中免疫細胞Treg和Th17的比例和功能，改善腸道炎癥，緩解UC小鼠病情，且中性pH菌液移植對UC小鼠模型治療作用及腸道微環(huán)境的改善作用最為顯著。

綜上，本實驗首次探討FMT治療UC中，菌液酸堿性對療效的影響，結(jié)果提示FMT菌液pH值為中性時，療效最佳。本實驗對提高FMT對UC的治療具有指導(dǎo)作用和臨床意義。