長莖葡萄蕨藻提取物對胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用

肖曄，盧芯儀，任天宇，鄒雄，劉忠群，高瑞麗，謝曦，王蓉，宋彥廷，胡文婷*

（1.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）屬綠藻門（Chlorophyta），蕨藻科蕨藻屬，主要生長在中國、日本、菲律賓、越南等國家的亞熱帶和熱帶海域[1]。長莖葡萄蕨藻是高價值的海水養(yǎng)殖藻類新品種，是一種天然可食用的綠色海藻。據(jù)文獻(xiàn)報道，長莖葡萄蕨藻富含海藻多糖、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等成分[2]，并且有增強(qiáng)免疫、降血壓、降膽固醇、抗氧化、抗炎、抑菌等多種潛在活性作用[3]，具有較好的營養(yǎng)和藥用開發(fā)價值。

胰脂肪酶是催化脂肪水解為甘油、脂肪酸等的關(guān)鍵酶，通過抑制其活性可延緩飲食中脂肪的水解，降低脂肪酸等的吸收，從而達(dá)到治療或預(yù)防肥胖的目的[4]。α-葡萄糖苷酶是碳水化合物在人體消化吸收的一種關(guān)鍵酶，其通過斷裂α-1，4糖苷鍵剪切下葡萄糖來參與糖代謝，當(dāng)其活性受到抑制時可延遲與減少人體對葡萄糖吸收，達(dá)到降低餐后血糖的效果[5]。目前常用的胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑，如奧司利他、阿卡波糖等，長期使用往往引起胃脹氣、腹瀉等副作用[6-7]。為了更好地預(yù)防和控制血脂和血糖異常的發(fā)生，尋找毒副作用低且效果良好的天然胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶等關(guān)鍵代謝酶的抑制劑已成為研究熱點(diǎn)。長莖葡萄蕨藻富含多種小分子活性成分，如蕨藻紅素、黃酮、萜類、多酚等[8-10]，這些成分使長莖葡萄蕨藻具備發(fā)揮多種生物活性的基礎(chǔ)。

目前關(guān)于長莖葡萄蕨藻對胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究鮮有報道。本研究以長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物為對象，測定其中的黃酮、多酚及萜類含量，以對胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶的抑制能力為評價指標(biāo)，通過相關(guān)性分析探究長莖葡萄蕨藻中可能存在活性的組分，并探討抑制能力最強(qiáng)萃取物的作用機(jī)制，以期為長莖葡萄蕨藻在維持血糖穩(wěn)定方面的應(yīng)用及相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮長莖葡萄蕨藻樣品：由海南文昌養(yǎng)殖場提供；α-葡萄糖苷酶（1 000 U/mL）、沒食子酸：北京索萊寶科技有限公司；胰脂肪酶（30 U/mg）、脫氧膽酸鹽：上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖（≥98%）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）、二甲基亞砜、無水碳酸鈉、阿拉伯樹膠、異丙醇、4-硝基苯棕櫚酸酯（p-nitrophenyl palmitate，PNPP）、香草醛、齊墩果酸、福林酚（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；奧利司他（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：廣州賽國生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：武漢賽維爾生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

VGT-1730QTD7超聲波清洗機(jī)：廣東固特超聲股份有限公司；5430R離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ME140E電子分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；181003E酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；F-4700熒光分光光度計：日本HITACHI公司；HH-2恒溫水浴鍋：江蘇科析儀器有限公司；DHG-9140A臺式恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3CepH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SIM-F140AY65-PCe制冰機(jī)：普和希健康醫(yī)療器械有限公司；UV/V1系列紫外可見分光光度計：上海翱藝有限公司。

1.3 方法

1.3.1 長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物的制備

新鮮長莖葡萄蕨藻洗凈、曬干，加入液氮研磨成粉末。以10倍體積的95%乙醇為溶劑，15℃超聲浸提40 min，超聲波功率為100 W，反復(fù)浸提3次。濾液合并后45℃減壓旋蒸至浸膏狀，加入少量去離子水重懸，依次用3倍量的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇充分萃取，濃縮并干燥各萃取液得到長莖葡萄蕨藻醇提物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后剩余的水萃取物。以上樣品儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多酚含量測定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，福林酚法測定樣品中多酚含量[11]。

1.3.3 萜類含量測定

以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，香草醛-冰醋酸-濃硫酸法測定萜類含量[12]。

1.3.4 黃酮含量測定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定黃酮含量[13]。

1.3.5 胰脂肪酶活性抑制活性試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[14]的方法，對胰脂肪酶的抑制活性進(jìn)行測定。取長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物，以二甲基亞砜復(fù)溶為100mg/mL母液，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液Tris-HCl（50 mmol/L，pH8.0，0.1%阿拉伯樹膠粉，0.2%脫氧膽酸鈉）稀釋至不同濃度作為測試樣液。采用比色法測定胰脂肪酶抑制活性，依次加Tris-HCl（pH8.0）75 μL、樣品溶液30 μL、36 U/mL胰脂肪酶75 μL于1.5 mL離心管中，于臺式恒溫鼓風(fēng)干燥箱中37℃氣浴反應(yīng) 10 min，再加入 0.2 mg/L PNPP 150 μL，氣浴37℃反應(yīng)15 min。待反應(yīng)結(jié)束后4 500 r/min離心5 min，取上清200 μL于405 nm波長下測定吸光度（OD），以奧利司他做陽性對照，平行測定3次。按照下列公式計算抑制率。

抑制率/%=[1-（OD3-OD4）/（OD1-OD2）]×100

式中：OD1為空白對照組吸光度；OD2為空白對照組背景吸光度；OD3為樣液組吸光度；OD4為樣液組背景吸光度。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行測定。取長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物，以二甲基亞砜（99.5%）復(fù)溶為100 mg/mL母液，用PBS（0.5 mol/L、pH6.8）稀釋至不同濃度作為測試樣液。采用微孔板法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，在96孔板上依次滴加磷酸緩沖液（pH6.8）40 μL、20 μL 樣品溶液、1.2 U/mL α-葡萄糖苷酶 20 μL，37 ℃反應(yīng) 10 min，加入 0.375 mmol/L PNPG 20 μL，振蕩搖勻，37 ℃反應(yīng)15 min。加入 80 μL 0.2 mol/L 的 Na2CO3溶液，于 405 nm波長下測定吸光度（OD），以阿卡波糖做陽性對照，平行測定3次，抑制率的計算公式同1.3.5中的公式。

1.3.7 抑制動力學(xué)試驗(yàn)

對胰脂肪酶的抑制動力學(xué)試驗(yàn)反應(yīng)體系同1.3.5。參考文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。測定不同質(zhì)量濃度（0、0.625 mg/mL） 的樣品在不同 PNPP 濃度（0.05、0.075、0.1、0.15、0.2 mg/mL）反應(yīng)體系中的反應(yīng)速率。對 α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)試驗(yàn)反應(yīng)體系同1.3.6，測定不同質(zhì)量濃度（0、0.08 mg/mL）的樣品在不同PNPG濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）反應(yīng)體系中的反應(yīng)速率。分別以反應(yīng)初速率的倒數(shù)（1/V0）為Y軸，濃度的倒數(shù)（1/[S]）為X軸繪制Lineweave-Burk雙倒數(shù)圖，經(jīng)圖形特征判斷其是競爭性抑制、非競爭性抑制或反競爭性抑制類型。抑制動力學(xué)按下列公式計算Lineweaver-Burk曲線方程。

式中：V為酶促反應(yīng)初速度，mmol/（L·min）；Km為米氏常數(shù)，mmol/L；Vmax為最大酶促反應(yīng)速率，mmol/（L·min）；[S]為底物濃度，mmol/L。

1.3.8 對酶相互作用的熒光分析

對胰脂肪酶相互作用的熒光分析參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行，取 0.2 mL 不同濃度樣品（0、0.312、0.625、1.25、2.5、3.5、5 mg/mL）和 0.5 mL 濃度為 36 U/mL 的胰脂肪酶溶液，用Tris-HCl（pH8.0）緩沖液補(bǔ)足至1 mL，混合均勻，分別在273、298、310 K3個溫度下靜置15min，于熒光分光光度計中檢測，設(shè)置激發(fā)波長為290 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，掃描得到310 nm～450 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜。

對α-葡萄糖苷酶相互作用的熒光分析參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行，取0.5 mL不同濃度樣品（0、0.007 5、0.03、0.06、0.3 mg/mL）和 0.5 mL 濃度 1.2 U/mL 的 α-葡萄糖苷酶溶液，混合均勻，在273、298、310 K 3個溫度下靜置15 min后放置于熒光池中，設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描得到300 nm～450 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜。

熒光猝滅過程采用下列Stern-Volmer方程[18]進(jìn)行判斷。

式中：F0為初始體系熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后的體系熒光強(qiáng)度；Kq為熒光猝滅速率，L/（mol·s）；τ0為無猝滅劑時物質(zhì)的熒光平均壽命，約為10-8s；Ksv為熒光猝滅常數(shù)，mL/mg；[Q]為猝滅劑濃度，mg/mL。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法

通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間差異按方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，最小顯著性差異法作兩兩比較，p＜0.05表示差異顯著。Graphpad prism 8作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類、黃酮含量分析

長莖葡萄蕨藻經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水處理得到4種不同極性萃取物，由于溶劑的極性不同，不同萃取物的成分存在較大差異，長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類、黃酮含量見表1。

表1 長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類、黃酮含量Table 1 Content of polyphenols，terpenoids and flavonoids in Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents mg/g

由表1可知，4個樣品中，乙酸乙酯萃取物的多酚含量（23.79 mg/g）和萜類含量（214.29 mg/g）最高，黃酮含量較高。石油醚萃取物中黃酮含量最高（3.27 mg/g），多酚含量（13.41 mg/g）和萜類（182.41 mg/g）含量僅次于乙酸乙酯萃取物。正丁醇和水層萃取物中多酚、萜類和黃酮含量明顯較低。乙酸乙酯從長莖葡萄蕨藻醇提取物中富集的多酚類和萜類成分含量最高，石油醚對其中的黃酮類物質(zhì)富集效果最佳。通過分步萃取，長莖葡萄蕨藻醇提物中多酚、萜類和黃酮成分得到初步的分離純化。

2.2 長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用

長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對胰脂肪酶的抑制作用見圖1。

圖1 長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對胰脂肪酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents on pancreatic lipase

由圖1可知，長莖葡萄蕨藻醇提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水萃取物對胰脂肪酶均有一定的抑制作用。石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物隨質(zhì)量濃度增加抑制效果逐漸增強(qiáng)，而當(dāng)質(zhì)量濃度高于一定值后逐漸達(dá)到平臺期，繼續(xù)增大質(zhì)量濃度抑制率增加不明顯。水萃取物隨質(zhì)量濃度增加，對胰脂肪酶的抑制作用表現(xiàn)出先升后降的趨勢。安歡等[19]對苦瓜提取物的研究顯示當(dāng)苦瓜提取物質(zhì)量濃度大于30 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制能力也表現(xiàn)出明顯的下降。推測造成這種結(jié)果的原因可能是由于水萃取物中同時還存在對兩種消化酶活力具有促進(jìn)作用的物質(zhì)，多種成分共同影響了與酶之間的相互作用結(jié)果。

長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖2。

圖2 長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents on α-glucosidase

由圖2可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，長莖葡萄蕨藻醇提物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制程度均整體提高，且當(dāng)各萃取物質(zhì)量濃度超過一定值后，隨著濃度的增大，抑制率的提高逐漸趨于平緩。

使用最小二乘法擬合曲線計算各萃取物對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用的IC50值，具體見表2。

表2 不同樣品對胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用比較Table 2 Inhibitory effects of different samples on pancreatic lipase and α-glucosidase

由表2可知，乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶抑制作用最強(qiáng)，其IC50為1.662 mg/mL，高于奧利司他（IC50=0.014 mg/mL），對α-葡萄糖苷酶也表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用，其IC50為0.017 mg/mL，高于陽性對照品阿卡波糖（IC50=0.001 mg/mL）。不同萃取物對胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶抑制率具有顯著性差異，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，對胰脂肪酶抑制率大小依次為乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物＞正丁醇萃取物。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，各萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制率大小依次為乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物。

從天然食品來源中獲得的消化酶抑制劑大多具有較溫和的作用效果。陳永麗等[20]對桑葉多糖的胰脂肪酶抑制作用研究表明其IC50為10.32 mg/mL，活性遠(yuǎn)低于相同條件下的陽性對照奧司利他（IC50為0.47 mg/mL）。滕俊英等[21]對苦蕎麥提取物的α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究結(jié)果顯示其IC50為241.79 mg/L，活性低于同條件下的陽性對照阿卡波糖。據(jù)文獻(xiàn)報道，由于奧利司他對胰脂肪酶抑制能力強(qiáng)，會干擾正常脂肪代謝，長期服用往往出現(xiàn)胰腺炎、胃腸脹氣等副作用。阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的強(qiáng)烈抑制作用會導(dǎo)致未消化的碳水化合物異常發(fā)酵，引起腹痛、腹瀉等胃腸道功能紊亂[6-7]。長莖葡萄蕨藻醇提物的萃取物由天然可食藻類經(jīng)初步分離獲得，具有相對溫和有效的抑制活性，可能對胃腸道的刺激較小，在開發(fā)天然降脂降糖功能性食品方面是一種優(yōu)質(zhì)的候選原料。

2.3 不同溶劑萃取物中多酚、萜類、黃酮含量與胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性分析

長莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類、黃酮含量與胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性見表3。

表3 不同溶劑萃取物多酚、萜類、黃酮含量與胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性Table 3 Pearson's correlation of content of polyphenols，flavonoids，and terpenoids of Caulerpa lentillifera extracts by different solvents with inhibitory activities against pancreatic lipase and α-glucosidase

如表3所示，萃取物中多酚、萜類含量與胰脂肪酶酶抑制率差異顯著（p＜0.05），萃取物中多酚含量與α-葡萄糖苷酶抑制率差異顯著（p＜0.05），因此，推測長莖葡萄蕨藻中對胰脂肪酶活性起抑制作用的主要活性成分可能為多酚與萜類物質(zhì)；對α-葡萄糖苷酶活性起抑制作用的主要活性成分可能為多酚類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，天然來源的小分子化合物具有多重降脂降糖藥理作用，其中對糖脂代謝中某些關(guān)鍵酶活性的調(diào)節(jié)是重要的途徑之一[22-23]。三萜酸類成分熊果酸和齊墩果酸是許多蔬菜水果和中藥中的活性成分[24]，對血脂和血糖的調(diào)節(jié)作用明顯，已經(jīng)證明它們具有很高的胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。周一鳴等[25]的研究表明苦蕎中的黃酮類物質(zhì)蘆丁和槲皮素對α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶活性具有抑制作用，存在治療糖尿病的潛力。柳余莉等[26]的研究發(fā)現(xiàn)楊梅中的多酚類物質(zhì)能顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性。研究表明由天然產(chǎn)物分離得到的多酚、黃酮、萜類物質(zhì)與降脂降糖活性明顯相關(guān)[27-28]，這些小分子物質(zhì)是挖掘生物活性的重要對象。

2.4 長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)試驗(yàn)

根據(jù)抑制劑結(jié)合酶的特點(diǎn)，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖及其相關(guān)參數(shù)，可判斷抑制劑對酶的抑制類型。酶的可逆抑制類型一般分為4種，分別為競爭性抑制（Vmax不變，Km增大）、非競爭性抑制（Vmax減小，Km不變）、反競爭性抑制（Vmax減小，Km減?。┖突旌闲鸵种疲╒max減小，Km增大或減小）。

因長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強(qiáng)，并且其中與酶抑制作用相關(guān)性最強(qiáng)的多酚和萜類物質(zhì)含量最高，因此以其為對象進(jìn)行酶抑制動力學(xué)研究。長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶抑制作用見圖3，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖4，其具體動力學(xué)參數(shù)見表4。

表4 胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)參數(shù)Table 4 Inhibitory kinetic parameters of pancreatic lipase and α-glucosidase

圖3 長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curves of inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate on pancreatic lipase

圖4 長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curves of inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate on α-glucosidase

由圖3可知，兩條斜率不同的直線相交于X軸。在反應(yīng)體系中添加長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物后最大反應(yīng)速率Vmax由58.207 mmol/（L·min）減小至47.687 mmol/（L·min），而米氏常數(shù)Km基本保持不變（表4）。長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶抑制類型符合非競爭性抑制特征，表明其不與底物競爭酶活性中心，而是與酶的其他基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合，既可以與胰脂肪酶形成復(fù)合物，又可以與胰脂肪酶-底物形成復(fù)合物，進(jìn)而影響底物的分解。此抑制類型的抑制程度取決于乙酸乙酯萃取物的質(zhì)量濃度，底物的濃度不會影響對胰脂肪酶的抑制程度。

由圖4可知，采用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖，得到兩條斜率基本相同的直線。在反應(yīng)體系中添加長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物后最大反應(yīng)速率Vmax由17.578mmol/（L·min）減小至2.572mmol/（L·min），米氏常數(shù)Km由1.818 mmol/L減小至0.284 mmol/L（表4）。長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制類型符合反競爭性抑制特征，說明其不與酶單獨(dú)結(jié)合，而是在酶與底物結(jié)合后，與胰脂肪酶-底物形成復(fù)合物，進(jìn)而影響底物的分解。此抑制類型的抑制程度同時取決于乙酸乙酯萃取物的質(zhì)量濃度與底物的濃度。當(dāng)前報道的天然產(chǎn)物來源的具有酶抑制活性的物質(zhì)種類繁多，涉及醌類、萜類、皂苷類、黃酮類、酚類、脂肪酸類等多種結(jié)構(gòu)的化合物[29]。抑制劑結(jié)構(gòu)的不同可能是造成不同抑制類型的原因。

2.5 長莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物與胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶相互作用的熒光分析

長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶相互作用的熒光分析見圖5，對α-葡萄糖苷酶的相互作用的熒光分析見圖6，其具體動力學(xué)參數(shù)見表5。

表5 胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer方程及參數(shù)Table 5 Stern-Volmer equations and parameters of pancreatic lipase and α-glucosidase

圖5 不同溫度下長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate against pancreatic lipase at different temperatures

圖6 不同溫度下長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對α-葡萄糖苷酶熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate against α-glucosidase at different temperatures

蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸等，在特定激發(fā)波長下可以發(fā)出不同的熒光。若受到其他條件的干擾，相應(yīng)的熒光發(fā)射峰會出現(xiàn)藍(lán)移和紅移的現(xiàn)象，據(jù)此可以判斷物質(zhì)與酶之間是否存在相互作用。

由圖5和圖6可知，在273、298 K和310 K 3種溫度下，當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時，胰脂肪酶最大發(fā)射峰（λmax）在343.8 nm附近，α-葡萄糖苷酶最大發(fā)射峰（λmax）在337.2 nm附近。當(dāng)在反應(yīng)體系中加入不同濃度的長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物時，胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性降低，且最大發(fā)射峰發(fā)生移動。胰脂肪酶最大發(fā)射峰從343.8 nm移動到361.2 nm，發(fā)生輕微的紅移。α-葡萄糖苷酶最大發(fā)射峰從337.2 nm移動到330.8 nm，發(fā)生輕微的藍(lán)移。這種現(xiàn)象表明長莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物與胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶之間均存在互作，改變酶的構(gòu)型使氨基酸殘基逐漸暴露于水相，所在環(huán)境極性發(fā)生變化，從而使酶的催化活性降低。

熒光猝滅機(jī)制主要包括兩種[30]，靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅。通過變溫試驗(yàn)，建立Stern-Volmer方程判斷長莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物與α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶之間的猝滅機(jī)制，分別在273、298 K和310 K 3種不同溫度下研究了兩種酶的熒光變化。由表5可知，隨著溫度的升高，長莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅常數(shù)Ksv值降低，對胰脂肪酶的Ksv由1.179 mL/mg降低至1.105 mL/mg，對α-葡萄糖苷酶的Ksv由3.693 mL/mg降低至2.377 mL/mg，說明其與胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶是通過形成復(fù)合物的方式發(fā)生靜態(tài)猝滅。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，長莖葡萄蕨藻醇提物的不同萃取物對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，其中長莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物的抑制作用最強(qiáng)，且抑制作用呈濃度依賴性。多酚和萜類物質(zhì)在石油醚與乙酸乙酯萃取物中含量較多，黃酮類物質(zhì)在石油醚萃取物中含量較多。對胰脂肪酶的抑制作用與多酚和萜類含量顯著相關(guān)，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用與多酚含量顯著相關(guān)。長莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶的抑制類型為非競爭性抑制，對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為反競爭性抑制，對胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的猝滅方式均為靜態(tài)猝滅。胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶作為人體重要的消化酶，在生物體消化吸收脂肪與碳水化合物的過程中發(fā)揮重要功能，長莖葡萄蕨藻可以抑制這兩種消化酶的活性，從而在維持血糖穩(wěn)定方面起到一定作用。長莖葡萄蕨藻在開發(fā)成輔助降脂降糖的功能性食品方面具有一定的潛力。