血藍蛋白生物活性研究進展

輝麗麗，李成會

(唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

0 引言

動物生命活動的存在與延續(xù)均依賴于有氧代謝，而絕大多數(shù)動物氧氣的運輸都需要借助體內(nèi)特殊的運載蛋白來參與，這類參與呼吸作用的蛋白質(zhì)家族就是呼吸蛋白。血紅蛋白是存在于脊索動物和部分軟體及節(jié)肢動物中的一種呼吸蛋白[1]，它與血藍蛋白和蚯蚓血紅蛋白并稱為動物界中的3種呼吸蛋白[2]。血藍蛋白的呼吸功能與血紅蛋白相似，但其分子結(jié)構(gòu)和作用機制存在顯著差異。血藍蛋白是一種多功能蛋白，存在于某些軟體動物、節(jié)肢動物的血淋巴中。研究表明，該蛋白與能量的貯存、滲透壓的維持及蛻皮過程的調(diào)節(jié)等多種生理生化功能有關(guān)[3]。

1 血藍蛋白的分布與結(jié)構(gòu)特點

血藍蛋白是一種含銅的呼吸蛋白，目前已知血藍蛋白存在于某些節(jié)肢動物與軟體動物血淋巴中。血藍蛋白含有2個直接連接多肽鏈的亞銅離子，易與氧結(jié)合，但在一定條件下也易與結(jié)合的氧進行解離，是唯一可與氧進行可逆結(jié)合的銅蛋白，與氧結(jié)合時呈現(xiàn)青藍色，而在脫氧狀態(tài)下則呈現(xiàn)無色[4]。

1.1 節(jié)肢動物血藍蛋白的分布及特點

節(jié)肢動物門的甲殼亞門、多足亞門、螯肢亞門和六足亞門中均含有血藍蛋白。在甲殼動物中血藍蛋白一直被認(rèn)為僅存在于軟甲亞綱，但研究表明槳足綱中也存在血藍蛋白；多足動物和六足動物具有發(fā)達的氣管系統(tǒng)，曾被認(rèn)為血淋巴系統(tǒng)中不存在血藍蛋白，但研究證實，蜈蚣類的2種蚰蜒和很多昆蟲的血淋巴系統(tǒng)中也存在血藍蛋白，在倍足綱的異蛩科中也發(fā)現(xiàn)了血藍蛋白的存在；在螯肢亞門中，血藍蛋白較早地發(fā)現(xiàn)于蛛形綱的蜘蛛，劍尾類的鱟和蝎類[5-6]。

目前已知節(jié)肢動物血藍蛋白超家族主要由酚氧化酶、擬血藍蛋白、昆蟲儲藏蛋白及昆蟲儲藏蛋白受體等成員組成[5]。節(jié)肢動物血藍蛋白的結(jié)構(gòu)為六聚體或以六聚體為單位構(gòu)成的復(fù)合六聚體。典型的節(jié)肢動物血藍蛋白由630～660個氨基酸構(gòu)成，其相對分子質(zhì)量為70～80 kD，并分為3個結(jié)構(gòu)域：第一個結(jié)構(gòu)域主要有α螺旋構(gòu)成，其主要包括N端的150～180個氨基酸，依靠超二級結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的螺旋束；第二個結(jié)構(gòu)域則包括2個銅離子結(jié)合位點：Cu A和Cu B，這2個結(jié)合位點均有2個α螺旋組成，且在每個α螺旋中通過3個組氨酸殘基與銅離子結(jié)合；第三個結(jié)構(gòu)域位于C端主要由β折疊組成，并進一步折疊為超二級結(jié)構(gòu)形成7股反向平行β桶結(jié)構(gòu)[5-6]。

1.2 軟體動物血藍蛋白的分布及特點

與節(jié)肢動物相比軟體動物的血藍蛋白分布較為局限，目前，僅在頭足類和腹足類中發(fā)現(xiàn)血藍蛋白。軟體動物的血藍蛋白不與血細(xì)胞直接結(jié)合而是在血淋巴中懸浮存在，隨著血淋巴的循環(huán)遍布全身提供氧氣，軟體動物的血藍蛋白是自然界中最大的呼吸蛋白，結(jié)構(gòu)復(fù)雜[7]。大部分軟體動物的血藍蛋白由分子量大小為400 kD的亞基構(gòu)成并形成圓柱體；少部分軟體動物如腹足綱和原鰓亞綱的血藍蛋白由2個十聚體聚合形成二十聚體；還有一些種類以十聚體為單位聚合形成多十聚體并進一步呈現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)；頭足綱和多板綱的血藍蛋白以單一十聚體形式存在[8-9]。

研究人員利用冷凍電鏡技術(shù)獲得了軟體動物鮑魚的清晰血藍蛋白四級結(jié)構(gòu)，并利用X晶體衍射技術(shù)發(fā)現(xiàn)軟體動物的血藍蛋白的相對分子質(zhì)量最大可達450 000Da，由7～8個大小相似(50 000Da)的功能單位(FU)組成，依次命名為a-h，氨基酸C端位于FU-h上，但頭足綱如鸚鵡螺血藍蛋白中血藍蛋白FU-h消失[10]。功能單位(Fu)由2個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即含有銅離子活性位點的α螺旋域和β折疊域。α螺旋域螯合1對銅離子，可結(jié)合1個O2；β折疊域可能含有Ca，維持四級結(jié)構(gòu)；α螺旋域與節(jié)肢動物血藍蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ具有相似功能，β折疊域則與節(jié)肢動物血藍蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ相類似[8]。

軟體動物的血藍蛋白模型顯示血藍蛋白由8個功能單位(Fu)組成，由核心結(jié)構(gòu)和外壁構(gòu)成。 模型核心結(jié)構(gòu)內(nèi)包括由2個同源的功能單位h構(gòu)成的領(lǐng)(頭足類中無領(lǐng)結(jié)構(gòu))，由功能單位g組成的拱，拱外為功能單位e、f，上述三部分共同構(gòu)成核心結(jié)構(gòu)。功能單位a、b、c和d構(gòu)成圓柱體外壁，兩個外壁反向組成二聚體，再由5個該種二聚體構(gòu)成十聚體血藍蛋白[8，10]。

2 血藍蛋白的生理生化功能

一般認(rèn)為，血藍蛋白與生物機體運輸氧相關(guān)，但近年來研究表明，血藍蛋白是一種多功能蛋白，除參與機體運輸氧以外還與機體能量的儲存和滲透壓平衡以及蛻皮相關(guān)，血藍蛋白還是節(jié)肢動物和軟體動物的重要免疫物質(zhì)，血藍蛋白存在酚氧化酶活性和抗菌性。

2.1 輸氧功能

血藍蛋白是以一價銅離子為主要作用離子的蛋白，氧與亞銅離子結(jié)合形成氧合血藍蛋白呈現(xiàn)藍色，脫氧血藍蛋白呈現(xiàn)無色。研究發(fā)現(xiàn)龍蝦血藍蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的雙銅活性中心，2個銅離子分別與3個組氨酸殘基的咪唑氮配位，未與氧結(jié)合時，2個銅離子間相距46 pm，相互間作用力小，銅離子與3個組氨酸殘基咪唑氮之間配位呈現(xiàn)三角形，在2個銅離子間未見蛋白質(zhì)本身提供的橋基；結(jié)合氧后，Cu(Ⅱ)位于四配位或五配位，2個銅離子與2個氧原子，在一個近似的平面上，2個銅離子均呈現(xiàn)平面正方形的構(gòu)象，這種配位是對Cu(Ⅱ)最有利的。此時Cu(Ⅱ)依靠氧原子間形成的過氧橋連接，兩者相距36 pm[3]。

許澤立[11]報道，以東亞飛蝗為研究對象，通過酶改變?nèi)芙庋鯘舛鹊姆椒?，采用極譜熒光法檢驗出東亞飛蝗卵和成蟲血淋巴的氧結(jié)合性質(zhì)。并利用PCR技術(shù)和基因重組技術(shù)研究了東亞飛蝗血藍蛋白的氧結(jié)合活性。王香香等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同階段的意大利蝗卵以及1齡蝗蝻的血藍蛋白2個基因Hc1和Hc2的表達量，結(jié)果表明血藍蛋白亞基基因Hc1和Hc2在整個意大利蝗卵發(fā)育過程均有表達，且具有階段特異性。Hc1與Hc2協(xié)同作用為蝗卵發(fā)育供氧，其中，Hc1主要負(fù)責(zé)蝗卵滯育后發(fā)育期間的氧氣運載，而Hc2主要維持滯育期間的氧氣運載，且載氧效率較低。

2.2 抗病毒功能

無論節(jié)肢動物血藍蛋白還是軟體動物血藍蛋白均具有抗病毒活性。Zhang Y L等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將斑節(jié)對蝦血清中2種能夠分別與白斑桿狀病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)和石斑魚虹彩病毒(Singapore Grouper Iridovirus，SGIV)結(jié)合的血藍蛋白與病毒混合培養(yǎng)3 d，細(xì)胞所受傷害不大；而不含血藍蛋白的對照組細(xì)胞完全裂解。進一步研究表明血藍蛋白在低濃度的情況下對病毒起到抑制作用，但并不能完全抑制病毒的復(fù)制。Lei K Y等[14]研究發(fā)現(xiàn)，日本對蝦的血藍蛋白對白斑桿狀病毒(White Spot Syndrome Virus ，WSSV)也表現(xiàn)出免疫活性。日本對蝦血藍蛋白的2個分子PjHcL亞基(75 ku)和 PjHcY亞基(73 ku)中的PjHcL亞基表現(xiàn)出抗病毒活性，而PjHcY亞基的抗病毒活性不明顯。Nesterova等[15]和 Zagorodnya等[16]研究發(fā)現(xiàn)，軟體動物脈紅螺血藍蛋白和亮大蝸牛血藍蛋白對皰疹病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)均表現(xiàn)出免疫活性。而Dolashka等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，脈紅螺血藍蛋白的糖基化亞基RvH-C對呼吸道合胞體病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)具有免疫活性，并進一步發(fā)現(xiàn)另一亞基RvH2-e的寡糖序列與血藍蛋白的抗病毒活性具有密切關(guān)系。

2.3 抑菌作用

血藍蛋白能夠通過自身裂解產(chǎn)生對微生物具有抗性作用的肽類物質(zhì)，從而產(chǎn)生對該種微生物的抑制作用。Zhang Y L等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納對蝦的血清中所存在的血藍蛋白是一種能夠與羊抗人IgG發(fā)生特異性反應(yīng)的IgG樣蛋白，血藍蛋白中存在Ig保守區(qū)，這些保守區(qū)域很有可能具有一定抗菌的功能。張澤蕙等[19]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦受到副溶血狐菌侵染后，其血淋巴中的具有5個分子量為6～31kD的兔抗血藍蛋白抗體，其中分子量為6kD的肽段與凡納濱對蝦的血藍蛋白具有同源性，并且對細(xì)菌具有明顯的抑制作用。而李長平等[20]報道，凡納濱對蝦的血藍蛋白及 6 種源于凡納濱對蝦血藍蛋白的化學(xué)合成肽段對黑曲霉具有明顯的抗性，可能與抑制黑曲霉孢子囊的生長發(fā)育有關(guān)。血藍蛋白的抑菌作用未對蝦等水產(chǎn)動物細(xì)菌、真菌病的防治提供新思路。

2.4 免疫活性及抗腫瘤活性

血藍蛋白還具有免疫活性和抗腫瘤活性，為抗菌肽的組成部分或前體物，在節(jié)肢和軟體等動物的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。郭睿等[22]報道，鑰孔血藍蛋白(KLH)可作為鯉魚類金魚免疫劑提高金魚自身的免疫活性。張晗等[21]運用超速離心、基因克隆、熒光定量PCR等技術(shù)對鮑的血藍蛋白進行了全面的研究分析，獲得了血藍蛋白的基因序列，超微結(jié)構(gòu)等結(jié)果，掌握了鮑血藍蛋白的免疫功能和表達調(diào)控規(guī)律，為以血藍蛋白為基礎(chǔ)的貝類免疫和病害防治打下了基礎(chǔ)。Gesheva 等[23]報道海產(chǎn)腹足類動物紅螺血藍蛋白是一種良好的免疫生物佐劑候選物。血藍蛋白的研究揭示了一些水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生理和免疫機制，這也為選育優(yōu)良水產(chǎn)養(yǎng)殖品種和對一些疾病的防治奠定了基礎(chǔ)。

血藍蛋白首次被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性是在1974年由Olsson等發(fā)現(xiàn)的匙孔血藍蛋白(KLH)能夠用于對淺表性膀胱癌的治療。隨后，各國學(xué)者進一步進行研究。曹勁松等[24]以對蝦血藍蛋白和人紅細(xì)胞為研究對象提出對蝦血藍蛋白與紅細(xì)胞可能通過硫氧還蛋白過氧化物酶實現(xiàn)靶標(biāo)結(jié)合，進而實現(xiàn)抗癌效果。陳傳道等[25]認(rèn)為血藍蛋白的抗腫瘤機制為血藍蛋白以某種方式進入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后，通過產(chǎn)生活性氧或醌類物質(zhì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞程序性凋亡或細(xì)胞自噬凋亡機制抑制腫瘤細(xì)胞生長。鄭莉媛等[26]報道，凡納濱對蝦血藍蛋白能夠通過線粒體的途徑對HeLa細(xì)胞產(chǎn)生作用。

2.5 凝集活性

李長平等(2017)研究發(fā)現(xiàn)[20]，凡納濱對蝦的血藍蛋白在胰蛋白酶的作用下能夠產(chǎn)生7條分子量大小在6～70kD的多肽分子，這幾種多肽分子混合后對副溶血弧菌具有顯著的凝集活性，比未分解的血藍蛋白凝集活性高出4～16倍。張澤惠等[27]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦、鋸緣青蟹血藍蛋白對副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、河弧菌(Vibrio fluvialis)、哈維氏弧菌(Vibrio har v eyi)、嗜水氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、金黃色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)和大腸桿菌 K12(Escherichia coli K12)等7種細(xì)菌具有凝集活性，凝集活性大小分別為0.27～1.08 mg/L和7.5～30 mg/mL。

2.6 酚氧化酶活性

血藍蛋白還具有酚氧化酶活性，最早于1998年由Decker發(fā)現(xiàn)。Guo 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，羅曼蝸牛、烏賊和釘螺等軟體動物血藍蛋白經(jīng)α-糜蛋白酶的作用后可表現(xiàn)出O-雙酚氧化酶活性。Perdomo 等[29，30]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和 SDS 處理的眼斑龍蝦血藍蛋白也表現(xiàn)出酚氧化酶活性。Kim 等[31]研究表明，北海道毛蟹體內(nèi)血藍蛋白在低溫的條件下(2.4℃～3.4℃)，經(jīng) SDS、脂多糖、磷壁酸等誘導(dǎo)也具有酚氧化酶活性。Coates 等[32]發(fā)現(xiàn)美洲鱟(Limulus polyphemus)體內(nèi)的磷脂酰絲氨酸在體內(nèi)同樣可激活血藍蛋白表現(xiàn)為酚氧化酶活性。Fujieda等[33]發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血藍蛋白5個單體均具有微弱的單酚氧化酶活性，且加入3M尿素后，其催化活性還可顯著提高。Dolashki等[34]發(fā)現(xiàn)軟體動物脈螺(Rapana venosa)血藍蛋白功能亞基RvH1-a經(jīng)SDS、胰蛋白酶以及尿素等處理后，可發(fā)揮一定的雙酚氧化酶活性。

3 結(jié)語

血藍蛋白作為節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的重要蛋白，在免疫、抗病毒、攜氧等方面具有重要作用。近年來對血藍蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行了較為深入的研究，但對于血藍蛋白在發(fā)揮免疫學(xué)功能的相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑、功能多樣性的分子機制及基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控機制等方面仍有待探索。有關(guān)血藍蛋白的研究，對血藍蛋白在生物信息傳導(dǎo)、生物藥開發(fā)、免疫抗體反應(yīng)、免疫佐劑研制以及選育抗逆優(yōu)良水產(chǎn)養(yǎng)殖動物品種和水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害檢測與防治等具有重要的理論價值和應(yīng)用價值。