核酸內(nèi)切酶影響IBV復(fù)制的分子機(jī)制

雞傳染性支氣管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus，IBV）引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病-雞傳染性支氣管炎（Avian infectious bronchitis，IB）。IBV nsp15 蛋白具有核酸內(nèi)切酶（EndoU）活性，EndoU 活性缺失可使IBV 復(fù)制出現(xiàn)缺陷，同時(shí)降低對(duì)雞的致病性，表明nsp15 蛋白是IBV 重要的毒力因子。但是nsp15 影響IBV 復(fù)制及其與宿主相互博弈的分子機(jī)制尚不清楚。

近期發(fā)表于《Journal of Virology》的研究論文，對(duì)IBV nsp15 影響病毒復(fù)制的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，并取得重要成果。細(xì)胞應(yīng)激顆粒（Stress granules，SGs）通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA 翻譯和定位，以及整合細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和抗病毒反應(yīng)，在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，常被病毒作為調(diào)控細(xì)胞環(huán)境的靶標(biāo)。作者以QX 型IBV 流行株（SD 株）感染雞胚原代腎細(xì)胞（CEK）后，觀(guān)察細(xì)胞中SGs 產(chǎn)生情況，結(jié)果顯示僅在感染后12 h觀(guān)察到約5%感染細(xì)胞產(chǎn)生SGs，其他采樣點(diǎn)均未觀(guān)察到SGs 的產(chǎn)生，說(shuō)明IBV 感染并不誘導(dǎo)感染細(xì)胞產(chǎn)生SGs。進(jìn)一步作者以亞砷酸鹽（Ars）為陽(yáng)性刺激物誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生SGs，觀(guān)察IBV 感染對(duì)Ars 誘導(dǎo)產(chǎn)生的eIF2a 依賴(lài)的SGs 是否具有抑制作用。結(jié)果表明在A(yíng)rs處理后可誘導(dǎo)80%以上的CEK 細(xì)胞產(chǎn)生SGs，而在IBV 感染的細(xì)胞中，僅有約20%的細(xì)胞觀(guān)察到SGs，大部分IBV 感染的細(xì)胞并未觀(guān)察到SGs 的產(chǎn)生。說(shuō)明IBV感染顯著抑制細(xì)胞中SGs的產(chǎn)生。

作者前期研究觀(guān)察到IBV nsp15 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以抑制PKR 的激活，PKR 激活后進(jìn)一步磷酸化eIF2a，引起細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)SGs 產(chǎn)生，因此推測(cè)IBVnsp15可能在病毒抑制SGs產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮作用。作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染nsp15-WT 后，細(xì)胞中未觀(guān)察到SGs 的產(chǎn)生，而在空載和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中可以觀(guān)察到30%～40%的細(xì)胞產(chǎn)生SGs。進(jìn)一步利用反向遺傳構(gòu)建拯救病毒株IBV rSD-WT 和EndoU 活性缺失病毒株（rSD-H238A 和rSD-Y334A），將上述拯救病毒株及親本病毒感染CEK 細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)親本病毒感染后未觀(guān)察到明顯的SGs產(chǎn)生；但當(dāng)rSD-H238A和rSDY334A 感染后觀(guān)察到明顯的SGs 形成，同時(shí)病毒復(fù)制出現(xiàn)缺陷。以上結(jié)果表明，nsp15是IBV抑制SGs形成的關(guān)鍵蛋白，且抑制功能與蛋白的EndoU活性相關(guān)。

IBV nsp15 EndoU 活性缺失導(dǎo)致病毒在CEK 細(xì)胞中的復(fù)制能力下降，且病毒N蛋白的分布形態(tài)與親本病毒也存在差異，其是否與誘導(dǎo)SGs 產(chǎn)生有關(guān)，為闡明這一問(wèn)題，作者在研究中對(duì)EndoU活性缺失病毒株感染細(xì)胞后SGs相關(guān)蛋白TIA1的分布形態(tài)以及與病毒N 蛋白和dsRNA 的定位情況進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)TIA1 蛋白從原來(lái)的彌散分布的形態(tài)聚集成為較大的顆粒狀態(tài)，表現(xiàn)出一種非典型的SGs 的形態(tài)，且與病毒的N蛋白和dsRNA 存在部分共定位情況。作者推測(cè)TIA1蛋白可能是在病毒EndoU 活性缺失之后影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵因素，接著在CEK 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)雞源TIA1蛋白，TIA1 蛋白穩(wěn)定表達(dá)后進(jìn)行病毒感染，發(fā)現(xiàn)感染后12 h，轉(zhuǎn)染PRK-EGFP（對(duì)照組）和PRK-EGFPTIA1（實(shí)驗(yàn)組）細(xì)胞中，N 蛋白的合成量未見(jiàn)明顯差異，但是到24 h，過(guò)表達(dá)TIA1 蛋白的CEK 細(xì)胞N 蛋白的合成出現(xiàn)明顯抑制，而表達(dá)EGFP 的細(xì)胞中N 蛋白的合成顯著增多。檢測(cè)CEK 細(xì)胞過(guò)表達(dá)TIA1 后IBV 的復(fù)制動(dòng)態(tài)，同樣驗(yàn)證了這一結(jié)果，表明在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TIA1 蛋白可以影響IBV 的復(fù)制，提示SGs相關(guān)蛋白TIA1可能是潛在的抗病毒因子之一。

該研究證明了QX 型IBV 感染后不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的SGs，且IBV nsp15 蛋白的EndoU 活性是抑制SGs 產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，同時(shí)SGs 相關(guān)蛋白TIA1 是潛在的抗病毒因子，為后續(xù)深入闡明IBV nsp15 蛋白調(diào)控冠狀病毒復(fù)制的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。