干細(xì)胞移植在糖尿病下肢血管病變治療中的應(yīng)用進展

李慧靈

（桂林市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 桂林 541002）

糖尿病下肢血管病變（Lower extremity vascular disease，LEVD）是指糖尿病患者下肢血管尤其是中、小動脈出現(xiàn)的慢性進行性狹窄和閉塞。此病常伴有下肢感覺神經(jīng)損傷。糖尿病LEVD 患者的早期癥狀主要是受累肢體出現(xiàn)冷感和疲勞感，多數(shù)患者缺乏外周動脈疾病的典型前期癥狀，如間歇性跛行和靜息痛。因此，糖尿病LEVD 可能在患者出現(xiàn)明顯組織病變前無法明確診斷[1]。糖尿病LEVD 若持續(xù)進展，最終可導(dǎo)致患者發(fā)生糖尿病足潰瘍和壞疽，而糖尿病足潰瘍和壞疽是導(dǎo)致非創(chuàng)傷性截肢的主要原因。LEVD 不是糖尿病患者特有的并發(fā)癥，但糖尿病患者LEVD 的發(fā)生率明顯高于非糖尿病患者。目前臨床上治療糖尿病LEVD 的方法較多，包括藥物治療、血管搭橋術(shù)、介入治療、血運重建術(shù)等。但藥物治療的療效不顯著，而血管搭橋術(shù)和介入治療的療效受限于患者術(shù)后較高的下肢血管再狹窄率。生長因子、自體富血小板凝膠和局部二氧化碳的使用被認(rèn)為有利于促進糖尿病足患者潰瘍面的愈合，但最新的糖尿病慢性足潰瘍干預(yù)指南明確表示不支持這一治療方式[2]。此外，由于手術(shù)的風(fēng)險高，因此有20% 以上的慢性肢體缺血患者因年老體弱或伴有彌漫性疾病、晚期疾病等自身原因而無法接受血管內(nèi)介入治療或血運重建術(shù)[3]。由此可見，探索更有效的治療糖尿病LEVD 的方法勢在必行。近年來，基于干細(xì)胞“治療性血管生成”特性的干細(xì)胞移植技術(shù)已成為臨床上治療糖尿病LEVD 的研究熱點。具有自我更新和多向分化增殖能力的干細(xì)胞在體內(nèi)、體外的特定環(huán)境下均可定向誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種特定細(xì)胞，參與血管再生、組織損傷修復(fù)等過程，從而可恢復(fù)和改善下肢血流，達(dá)到治療糖尿病LEVD 的目的。本文回顧了目前報道的采用干細(xì)胞移植療法治療糖尿病LEVD 的相關(guān)文獻，概述了干細(xì)胞的類型及干細(xì)胞移植治療下肢血管病變的相關(guān)進展，以獲得關(guān)于干細(xì)胞移植作為糖尿病LEVD有效治療手段的可靠證據(jù)，為下肢缺血性疾病的治療提供參考和借鑒。

1 干細(xì)胞類型

干細(xì)胞是一類具有無限自我更新和多向分化能力的“萬能細(xì)胞”。一般來說，可根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育階段將其分為兩大類，即胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESCs）和成人體細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）。ESCs 亦 稱 為 誘 導(dǎo) 多 能 干 細(xì) 胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），具有全能性，可分化成成人身體器官或組織的任何細(xì)胞。ESCs 一般是在受精后4 ～5 d 內(nèi)從胚泡內(nèi)部的細(xì)胞團中獲得的。ASCs具有組織特異性，其分化潛力具有局限性，一般存在于各類器官中，其在特定器官或組織中只能分化為該器官或組織的特殊細(xì)胞類型。ASCs 根據(jù)組織來源可分為造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSCs）和肌肉干細(xì)胞（muscle stem cell，MuSCs）等[4]。ASCs 因 具 有 分 化成各種特定細(xì)胞類型的內(nèi)在潛力，且一直存在于人體組織內(nèi)部，因此一直被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵治療元素，在干細(xì)胞移植治療中受到了廣泛重視。目前用于移植的干細(xì)胞通常有以下幾種：iPSCs、HSCs、骨髓單核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNC）、 內(nèi) 皮 祖 細(xì) 胞（endothelial progenitor cells，EPCs）及包括臍帶、臍血和骨髓等來源的MSCs。這些干細(xì)胞均有多向分化的潛能，可用于不同組織和器官的移植。

2 干細(xì)胞移植治療的現(xiàn)狀

1997 年有學(xué)者首次從血液中分離出EPCs，并發(fā)現(xiàn)其可以發(fā)育成血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進血管的重建。之后通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，EPCs 具有定向歸巢的特性，能主動趨向移植肢體的局部缺血和血管損傷部位，并通過旁分泌血管生長因子〔如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等〕促進新生血管的形成，建立側(cè)支循環(huán)，使缺血肢體的血液流動得到改善，從而改善肢體缺血的狀態(tài)。2002 年，日本學(xué)者Tateishi-Yuyama E等首次在人體試驗中通過骨髓干細(xì)胞移植治療糖尿病LEVD，結(jié)果表明干細(xì)胞具有“治療性血管生成”的作用，能明顯改善和恢復(fù)糖尿病LEVD 患者下肢的血液灌流量，取得了令人滿意的療效[5]。國內(nèi)夏穩(wěn)伸等[6]通過對13 個干細(xì)胞移植治療糖尿病LEVD 的隨機對照試驗（RCT）進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植組患者相比常規(guī)治療組患者的踝肱指數(shù)（ABI）、經(jīng)皮氧張力（TcPO2）、靜息痛、肢體冷感、側(cè)支血管新生及截肢率均有不同程度的改善。

2.1 自體骨髓干細(xì)胞移植

骨髓是人體中最豐富的干細(xì)胞池。BM-MNC 是具有自我更新和多向分化潛能的原始骨髓細(xì)胞。成年個體的BM-MNC 中包含骨髓來源的MSCs（BMMSCs）、EPCs、HSCs 等龐大的干/ 祖細(xì)胞成分，其中EPCs 的含量約占3%，超過外周血的15 倍。具有CD34+標(biāo)記的BM-MNC 是EPCs 的主要來源，BMMNC 在特定條件下可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等，且移植后可通過旁分泌VEGF等血管生長因子促進新生血管的形成和缺血損傷的修復(fù)。對后肢缺血家兔模型進行BM-MNC 移植4 周后，通過血管造影檢查發(fā)現(xiàn)，局部移植BM-MNC 可產(chǎn)生功能性EPCs，有效促進家兔缺血后肢的血管生成和側(cè)支血管形成。而對后肢缺血糖尿病大鼠模型進行實驗發(fā)現(xiàn)，將骨髓干細(xì)胞局部肌內(nèi)注射至大鼠的缺血肢體后，在其缺血后肢中實現(xiàn)了血液灌注的恢復(fù)。提示BM-MNC 誘導(dǎo)的治療性血管生成可能是糖尿病LEVD患者的一種安全有效的治療方法。馬海濤等[7]對60例糖尿病LEVD 患者的36 條患肢進行BM-MNC 移植，移植20 周后經(jīng)血管造影證實患者的ABI、TcPO2和血氧水平（BOLD）較移植前均有不同程度的升高，其缺血下肢的血流灌注量得到明顯改善和恢復(fù)，新生血管和側(cè)生血管形成明顯增加，其截肢手術(shù)率明顯降低。谷涌泉等[8]對糖尿病LEVD 患者實施自體BMMNC 移植治療，發(fā)現(xiàn)治療后患者的疼痛明顯緩解，ABI 和TcPO2均明顯升高，部分患者的間歇性跛行癥狀較治療前明顯好轉(zhuǎn)，其截肢率和截肢平面明顯降低。同時，該研究還證實了用經(jīng)下肢動脈導(dǎo)管注射和肌內(nèi)局部注射這兩種不同的自體BM-MNC 移植方法治療糖尿病LEVD 的效果并無顯著性差異。這為自體骨髓干細(xì)胞移植治療糖尿病LEVD 的臨床應(yīng)用提供了有力證據(jù)。存在于各種組織器官中的MSCs 具有多向分化潛能，通常表達(dá)CD90、CD105 和CD73 標(biāo)記，在干細(xì)胞移植治療方面受到了廣泛關(guān)注。臨床上治療糖尿病足慢性不愈合潰瘍最有效的方法之一就是自體植入BM-MSCs。有學(xué)者在大鼠下肢缺血模型中分別進行BM-MSCs 移植和BM-MNC 移植，結(jié)果表明BMMSCs 移植較BM-MNC 移植能更有效促進新生血管的形成。劉璠等[9]對比了用自體BM-MSCs 移植和BMMNC 移植治療糖尿病LEVD 的療效，結(jié)果顯示，隨訪24 周后BM-MSCs 組患者的無痛步行時間、ABI、TcPO2、肢體血流灌注量和潰瘍愈合率等指標(biāo)相較于BM-MNC 組患者提升更為顯著。表明在促進糖尿病LEVD 患者的下肢血流灌注和足部潰瘍愈合方面，BM-MSCs 移植可能比BM-MNC 移植具有更好的耐受性和有效性。

2.2 外周血干細(xì)胞移植

雖然目前認(rèn)為自體骨髓干細(xì)胞移植具有細(xì)胞采集操作簡單、方便直接及費用較低等優(yōu)勢，但同時也存在需要局部麻醉、骨髓采集創(chuàng)傷較大、采髓量高、對患者身體狀態(tài)要求較高及危險性較大等缺點，限制了該治療方法的臨床使用。外周血干細(xì)胞移植（peripheral blood stem cell，PBSCs）是通過應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動員骨髓干細(xì)胞從骨髓分泌到外周血循環(huán)中，從而提高外周血中EPCs 和HSCs數(shù)量，以達(dá)到干細(xì)胞移植要求的一種治療方式。正常狀態(tài)下，外周血中EPCs 的含量極低，經(jīng)過G-CSF 動員后外周血中EPCs 的含量可提高1% ～10%，再通過細(xì)胞分離機將外周血循環(huán)中的PBSCs 分離出來，用于干細(xì)胞移植。早期通過糖尿病肢體缺血動物模型證明，進行EPCs 移植治療能有效改善糖尿病肢體缺血動物模型缺血肢體的血流灌注，促進其潰瘍面的愈合。盧愛俊等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病LEVD 患者在接受PBSCs 移植治療后，其ABI、TcPO2等客觀指標(biāo)均得到提升，間歇性跛行得到改善，潰瘍面愈合。提示通過PBSCs 移植可增強糖尿病足潰瘍患者下肢的血液供應(yīng)。研究表明，CD34+細(xì)胞似乎是一個豐富的EPCs群體，是治療潰瘍的良好候選細(xì)胞。上述研究均表明PBSCs 移植是治療糖尿病LEVD 的一種簡單、安全、有效的新方法。陳明衛(wèi)等[11]比較了用自體BM-MNC移植和PBSCs 移植治療糖尿病LEVD 的效果，發(fā)現(xiàn)用這兩種干細(xì)胞移植療法治療糖尿病LEVD 的效果相當(dāng)。然而，PBSCs 移植療法在應(yīng)用時由于需要長時間以G-CSF 動員骨髓單核細(xì)胞的形式進入外周血循環(huán)，因此容易會造成血液的黏稠度升高，引起血管內(nèi)血栓形成，進而可增加患者心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險[12]。因此，在整個骨髓動員過程中，應(yīng)注意為患者采取抗凝措施，以預(yù)防其出現(xiàn)心腦血管并發(fā)癥。

2.3 臍血干細(xì)胞移植治療

臍血干細(xì)胞（bilical cord blood stem cell，UCB）因其來源豐富且制備便利，現(xiàn)已成為HSCs 和EPCs的重要替代來源，越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。臍血中CD34+細(xì)胞的含量為成人外周血中該細(xì)胞含量的10倍，且其增殖分化能力明顯高于骨髓干細(xì)胞，產(chǎn)生EPCs 的能力更強。文獻報道，UCB 移植可有效提高兔后肢動脈球囊損傷模型血液中一氧化氮（NO）的濃度，抑制血管內(nèi)膜的增生，改善其損傷血管內(nèi)皮的功能[13]。于鳳泉等[14]研究證實，應(yīng)用UCB 移植聯(lián)合介入治療可有效改善糖尿病LEVD 患者的VEGF、ABI、TcPO2和肢體冷感等客觀指標(biāo)，且相較于單獨應(yīng)用介入治療，聯(lián)合應(yīng)用UCB 移植與介入治療起效更快，且療效更持久。馬紅芳等[15]研究表明，UCB 移植可明顯促進糖尿病LEVD 患者新生血管和側(cè)支循環(huán)的形成，改善受損血管內(nèi)皮的功能，降低介入治療后再狹窄的發(fā)生率，且UCB 移植與血管介入治療兩者聯(lián)用相比單獨應(yīng)用介入治療的療效和遠(yuǎn)期預(yù)后更佳。

3 存在的問題與展望

用干細(xì)胞移植療法治療糖尿病LEVD 可有效改善和恢復(fù)患者的下肢血流灌注，促進血管新生。然而，大多數(shù)關(guān)于該療法的研究都是通過糖尿病LEVD 動物模型進行的基礎(chǔ)研究，關(guān)于該療法的臨床研究仍然太少。鑒于用干細(xì)胞移植療法治療其他慢性疾?。ㄈ绺甙l(fā)病率的潰瘍等）具有巨大的治療潛力，因此有必要在人體受試者中進行更多的臨床試驗來證明其安全性、有效性和耐受性。同時，盡管自體干細(xì)胞是干細(xì)胞移植治療中最常用的細(xì)胞類型，但未來更多地探索iPSCs 和異基因或異種干細(xì)胞移植仍是十分必要的。通過G-CSF，有助于動員骨髓干細(xì)胞分泌到外周血中，并促進傷口的愈合，因此建議將其作為外周血干細(xì)胞移植治療的輔助手段。對于需要血運重建的糖尿病LEVD 患者，在行干細(xì)胞移植治療的同時聯(lián)合實施血管成形術(shù)是一種很有前景的治療方式，但干細(xì)胞移植是否能被用作血管成形術(shù)的輔助治療手段仍有待確定。此外，在干細(xì)胞移植治療中，干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量尤為關(guān)鍵。在許多干細(xì)胞移植治療方案中，移植在患者體內(nèi)的干細(xì)胞存活率很低，這是制約該治療方案臨床應(yīng)用和推廣不可忽視的障礙。除了細(xì)胞在體內(nèi)存活的問題外，干細(xì)胞移植治療的局限性還包括應(yīng)用來自胚胎和臍帶血異體干細(xì)胞的相關(guān)倫理問題、致畸潛力、對骨髓來源細(xì)胞侵入性收獲技術(shù)的需求及免疫原性等問題。此外，不同研究之間的干細(xì)胞來源、移植細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞給藥途徑也不相同?？紤]到干細(xì)胞的異質(zhì)性，還有待大量高質(zhì)量的臨床隨機對照試驗對干細(xì)胞移植治療的安全性、有效性及遠(yuǎn)期療效予以證實，且建立一套行之有效的規(guī)范化治療指南和完整、客觀的療效評價系統(tǒng)也勢在必行。